??3。人参 白术 茯苓 甘草 : 【中医理论】人参(去芦)、白术、茯苓(去皮)、甘草(炙)各等份。又名四君子汤,载《太平惠民和剂局方》,用于脾胃气虚证。人参甘温益气,健脾养胃,白术苦温,健脾燥湿,加强益气助运之力,茯苓甘淡,健脾渗湿,苓、术合用,则健脾祛湿之功更显。炙甘草甘温,益气和中,调和诸药,四药配伍,共奏益气健脾之功,能使脾胃之气健旺,运化复常,资生气血,故为补气的基本方。后世以补气健脾为主的许多方剂,多从本方发展而来。如异功散为四君子汤加陈皮而成,芳香健脾醒胃,使甘温缓补更兼理气健脾之功。再加半夏为六君子汤,《名医方论》张璐言:“气虚者,补之以甘。参、术、苓、草,甘温益胃,有健运之功,具冲和之德,故为君子。益人之一身,以胃气为本,胃气旺,则五脏受荫;胃气伤,则百病丛生,故凡病久不愈,诸药不效者,惟有益胃补肾两途,故用四君子随证加减。”也临床实际应用有以党参代人参使用,也称四君子汤。【药理研究】1。显微鉴别取本品丸剂,置显微镜下观察:不规则分枝状团块无色,遇水合氯醛液溶化;菌丝无色或淡棕色,直径4～6μm。联结乳管直径12～15μm,含细小颗粒状物。草酸钙针晶细小,长10～32μm,不规则地充塞于薄壁细胞中,纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶,形成晶纤维[1]。2。薄层色谱鉴别2。1 四君子丸中白术的薄层色谱鉴别方法取丸剂2g,研碎,加正己烷10ml,超声处理15min,滤过,滤液挥干,残渣加正己烷1ml使溶解,作为供试品溶液。另取白术对照药材0。2g,加正己烷2ml,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱试验,吸取上述制备的两种溶液各10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90℃)一醋酸乙酯(20:0。1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点[1]。2。2 四君子丸中甘草酸薄层色谱鉴别方法取丸剂5g,研碎,加水40ml,煎煮30min,滤过,滤液用正丁醇振摇提取3次,每次15ml,合并正丁醇液,用水洗涤3次,每次10ml,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇0。5ml使溶解,作为供试品溶液。另取甘草对照药材0。5g,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验,吸收供试品溶液4μl,对照药材溶液1μl,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上,以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃烘至斑点显色清晰,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。2。3 四君子汤薄层扫描特征指纹图谱的研究[2]张莅峡等选用了薄层扫描中的三种检测方式:荧光检测,紫外光检测,可见光检测(包括显色前后的测定),在同一块层离板上,可以同时获得四种不同的四君子汤的薄层扫描的特征峰指纹图谱。通过单味药与成药进行阴阳双对照,可以确认白术、甘草和党参的存在。四君子汤提取液:按处方标示量,分别称取经粉碎(过40目筛)的四种单味药,混匀后,放入磨口三角瓶中,加一定量的95%乙醇溶液,将磨口三角瓶置于超声清洗器中,超声1。5h后,将药液与药渣转移至离心管中,进行离心分离,分取上清液置具塞容器中,备用(表12-3-1)。阴、阳对照液的制备:按处方(中国药典一部)比例称取一定量。分别在各种阴、阳对照品中,加入一定量乙醇,参照上述四君子汤提取相同的提取方法提取,超声,离心,分取上清液备用。表12-3-1 四君子汤阴、阳对照液的制备(单位g)药品党参白术茯苓炙甘草阴(-)阳(+)阴(-)阳(+)阴(-)阳(+)阴(-)阳(+)党参白术茯苓炙甘草00。20。20。10。20000。200。20。100。2000。20。200。1000。200。20。20。200000。1薄层板的制备:称取6g硅胶GF254,加入0。3%CMC-NA水溶液18 ml,经充分研磨后,均匀地涂布在20cm×20 cm玻璃板上,薄层厚度约0。25mm,在室温25℃下自然风干后,置105℃烘箱中活化2h,放干燥处备用。展开剂:a。氯仿-甲醇-水(15:10:6)下层;b。氯仿-甲醇-水(11:6:2)下层。饱和时间:20min。展开方式:倾斜上行法。展开时间:1 h。展距:12～13 cm。将样品溶液及阴、阳对照液分别量取5μl,点样,将板置于层析缸中,按上述层离条件进行层离。层析完毕后,将板置通风厨中,待溶媒挥散尽后,取出,待鉴定。扫描条件见表 12-3-2。表12-3-2 薄层扫描条件项 目荧光(FL)紫外光(UV)可见光(Vis)可见光(C-Vis显色后)光 源测定波长(nm)氙灯λEX330λEm450氘灯λS258λR400钨灯λS390λR800钨灯λS400λR800吸收方式扫描方式狭缝宽度(mm)扫描速度(mm/min)记录速度(mm/min)散射系数SX 反射锯齿1。25×1。2520107 薄层扫描图中特征峰的归属见表12-3-3,表12-3-4,表12-3-5。表12-3-3 四君子汤荧光薄层扫描图谱中特征峰的归属表12-3-4 四君子汤紫外光薄层扫描图谱中特征峰的归属表12-3-5 四君子汤可见光薄层扫描图谱中特征峰的归属注:展开剂②,10%硫酸-乙醇显色综述实验可见:实验选择了多种展开剂系统,经比较,确认氯仿-甲醇-水(15:10:6)和正丁醇-乙醇-氨水(3mol)(5:1:2)两种展开剂所获得的图谱清晰,特征性较强,比较理想,鉴于前者比后者稍节约时间,因而选择了前者为实验的展开剂。而对于党参的检出,虽用展开剂a亦可以检出,但不如将此体系比例调整为氯仿-甲醇-水(11:16:2)检出更清晰。因此在鉴定中选用了两种比例的氯仿-甲醇-水体系作展开剂。实验选用了超声浸提技术,并与热提法作了对比,无论从紫外检测、荧光检测,或是可见光检测图谱上看,二法提取的组分从图的形状、峰强度及其峰的数目基本一致。对于传统中药方剂分析,在同一块层离板上可以获得4种不同的四君子汤的薄层扫描指纹图谱。以荧光检测所获得的图谱灵敏度最高、特征性和选择性强,特别对于甘草的鉴定十分灵敏,并可鉴别白术。紫外光检测灵敏度不如荧光,但图谱别具特征,可鉴别白术和甘草。未显色前的可见光检测,主要可识别甘草;用10%硫酸-乙醇液和10%磷钼酸显色后所获得的可见光薄层扫描图,鉴定党参是十分有利。由4种不同检测方式所获得4种图谱,各具特色,可以从不同角度多层次地认识四君子汤的总体面貌,从而加深对复杂的、多组分的中药的客观认识,进而了解其多组分间的相互关系,使薄层扫描研究传统中药的方法上得到充实和提高。在实验中,选择λS285 nm/λR400 nm作为紫外光检测波长,对于炙甘草阳性对照液可以观察到8个较明显的峰,当波长为λS260 nm/λR400nm时,却多出现了4个倒峰,十分明显,这4个倒峰也是炙甘草的特征峰,在四君子汤的薄层扫描图上同样出现。在中药方剂研究中可充分利用多种信息,以满足不同需求。以薄层扫描法鉴定了四君子汤中的三味中药的客观存在,茯苓在上述条件下,不具备较特征的峰。3。含量测定3。1 四君子汤中黄酮类化合物的含量测定(比色法)[3]分析样品制备:称取党参、白术、茯苓各5g,甘草2。5g。加蒸馏水200ml,浸泡20min。分别煎煮20、30、40、50 min,趁热过滤,收集滤液。各重煎煮1次。合并两次滤液使成200 ml,放置过夜。取此煎液10 ml,离心20 min(1000 r/min),备用。样品测定:取上述分析样品2。5 ml,加蒸馏水2。5 ml稀释,再分别加入0。1 mol/L三氯化铝溶液3 ml和1 mol/L醋酸钾溶液5 ml,放置40 min,于415 nm处比色。记录吸收度值,以吸收值查标准曲线得查表浓度,按下式煎液黄酮类含量=3。2 四君子汤中甘草酸的含量测定(高效液相色谱法)[4]样品制备:取党参、白术、茯苓各10 g,甘草5 g,加蒸馏水浸20 min,前煮30 min,过滤,重煎1次,合并2次滤液,适当浓缩后离心(1 000 r/min)15 min,最后使上清液成35 ml,(即1m药液相当于1 g原生药)备用。标准曲线制备:取甘草酸单铵盐分别配制成浓度为0。0446、0。0892、0。1338、0。1784 mg/ml。于UVλ249 nm处、流动相为甲醇-水(60:40)、流速20 ml/min,进样量20μl、ODS柱、压力1980psi进行测定,记录峰高值,以浓度为横坐标,峰高值为纵坐标,绘制标准曲线(未进样时吸收度为0)。在实验浓度范围内测定,线性关系良好,回归方程Y(h)=97。44X(c)-0。07,r=0。9999。样品测定:取制备好的分析样品0。5ml,以脱气后的甲醇-水(60:40)稀释至50ml,经硅镁吸附剂小柱过滤。取此滤液20μl于色谱仪上测定,流动相甲醇-水(60:40)、流速2。0 ml/min、ODS柱、压力1980psi、测定波长249 nm,测定结果按下式计算结果。结果见表12-3-6。表12-3-6 四君子汤水煎液中甘草酸的含量测定结果实验次数测定峰高(cm)测定浓度(mg/ml)水煎液中甘草酸单铵盐浓度(mg/ml)甘草酸单铵盐煎出率(%)甘草酸煎出率(%)12345平均值5。286。285。164。854。935。300。054910。065170。053670。050490。051310。055115。4916。5175。3675。0495。1315。5113。844。563。763。533。593。863。774。473。683。463。523。78加样回收实验:在第一个样品中加入标准品,测定其回收率,加入浓度为0。08384mg/ml,结果见表12-3-7。表12-3-7 加样回收率测定结果实验次数测定量(mg/ml)回收率(%)CV(%)10。0772792。17 2340。078300。075630。0774893。3990。2192。411。447注:加入量为0。08384mg/ml不同煎煮时间的四君子汤水煎液中甘草酸的含量比较:煎煮时间分别为10、20、30、40、60min。其余方法如前,测定结果见表12-3-8。表12-3-8 不同煎煮时间对四君子汤甘草酸含量的影响煎煮时间(min)水煎液中甘草酸含量(mg/ml)平均含量(mg/ml)12345103。7003。8213。8404。062 3。8562030405。0385。3794。6054。1726。3854。2034。5245。2585。4794。2034。9465。6004。3145。0274。4505。3994。972604。2734。6055。1074。6255。5204。826实验表明,不同煎煮时间对四君子汤水煎液中甘草酸的含量有影响,即煎煮时间由10～30min呈增加趋势,40min后呈平缓下降。这种变化在黄酮类化合物的含量测定中亦可见到。造成此种变化的原因,可能是茯苓中大量淀粉随着煎煮时间的延长,其糊化程度亦随着增加,水煎液中的吸附和包容现象均增加所致。3。3 四君子汤中总氮量和还原糖定量分析[5]四君子汤:人参(红参)、茯苓、白术、甘草各6g。四物汤:当归、川芎、白芍、熟地各6g。八珍汤:人参、茯苓、白术、甘草、当归、川芎、白芍、熟地各6g,生姜3片,大枣2枚。总氮量测定:将上述各方分别置于500ml的烧杯中,依次加入250ml、250ml和350ml的蒸馏水中,浸泡30min,煎煮,第1次煎煮50min后,取出煎液,过滤,药渣加入蒸馏水继续煎煮40min,过滤,合并2次煎液,抽滤后分别于500ml容量瓶中,定容后得供试液。取供试液20ml于消化管中,微火蒸发水分,同时加入H2SO48ml,在150℃消化2h后,转入450℃的温度下继续消化3h后,用适量蒸馏水溶解洗涤后于25ml的容量瓶中定容,取试液于自动凯氏定氮仪上测定,结果为四君子汤:6。46mg/g,八珍汤:5。83mg/g,四物汤:5。55mg/g。从总氮量的测定结果来看,四君子汤、四物汤、八珍汤中均含有丰富的蛋白质、氨基酸,其中以四君子汤中最高,八珍汤中次之,四珍汤中为低。还原糖的测定:分别按四君子汤、四物汤、八珍汤的药物剂量之半精密称定后组成各方,置于烧杯中,各加85%的乙醇溶液20 ml,然后水浴加热(55℃)浸提2h,将浸提液取出,每样重复3次,合并3次提取液,并用蒸馏水定容于1000 ml的容量瓶中,精取20 ml提取液于烧杯中,在55℃的水浴中蒸干,加入300 ml蒸馏水溶解,加1 g活性碳脱色过滤,滤液呈无色透明,将活性碳漂洗几次,然后定容于500 ml容量瓶中,留作比色测定。取供试液1。00 ml放于试管中,加入5%苯酚液1。00 ml,再迅速加入5。00 ml浓硫酸。此时溶液呈淡黄色,冷却,摇匀,在490 nm处进行比色测定含量,结果为四君子汤:19。6%,四物汤:32。6%,八珍汤:27。5%。从还原糖的分析结果来看,以四物汤中含糖量为最高,八珍汤中次之,四君子汤为最低,可能与四物汤、八珍汤中含有熟地等含糖量高的药材有关。3。4 四君子汤中游离氨基酸的定量分析[6]龚氏等对四君子汤中游离氨基酸进行了研究,同时对剂量不一的原方和新版教材方中的氨基酸进行了比较研究。四君子汤:人参、茯苓、白术、甘草各6 g;新四君子汤:人参10g,茯苓9g,白术6g,甘草6g(全国高等医药院校教材《方剂学》第5版),分别按上述剂量称取药物组成各方,并置于250 ml的圆底烧瓶中,分别加入160 ml的70%乙醇回流提取1。5 h,滤取醇提液,药渣按上法继续回流提取,共计3次,合并3次醇提液,减压回收乙醇至无醇味,浓缩,于100 ml和250 ml容量瓶内定容,冷藏作供试液。取供试液分别稀释至5倍,然后取50μl试液用氨基酸分析仪进行测定,其结果见表12-3-9。表12-3-9 四君子汤中氨基酸分析结果(μg/g) 四君子汤新四君子汤天冬氨酸丝氨酸谷氨酸甘氨酸丙氨酸胱氨酸缬氨酸异亮氨酸亮氨酸酪氨酸苯丙氨酸赖氨酸组氨酸精氨酸脯氨酸总氨基酸含量962。64387。46109。6927。96173。9326。7867。01195。2557。21217。2851。28217。2092。132496。943163。098245。851208。47528。36263。5478。16450。4172。68186。70275。64165。12717。7291。99367。69139。894746。263508。6212801。22从表12-3-9中可以看出四君子汤中含有丰富的氨基酸。3。5 四君子汤中微量元素的定量分析[7]取称10g单味中药置瓷坩埚中,加250ml去离子水浸泡,0。5h后分别置于控温电热板上煮沸,调节电热板温度保持微沸状态0。5h,趁热滤进250ml容量瓶,配到刻度。第2煎将各药再加250ml去离子水加热至沸,保持微沸状态0。5h,滤进250ml容量瓶,配到刻度。按四君子汤剂量配方,在方剂中加去离子水500ml,重复上述过程,最后配到500ml的容量瓶中。第2次煎液重复上述过程。铁、锰、锌、铜、用火焰法测定。钴、铬、用石墨炉法测定,其结果见表12-3-10。表12-3-10 四君子汤及组方药物首煎、二煎微量元素测定元 素FeMnZnCuCoCr党参首煎二煎19。64。528。481。854。651。552。981。550。3030。3000。4400。088白术首煎二煎16。23。1210。21。7514。302。486。351。421。520。0880。2750。018茯苓首煎二煎13。55。287。023。722。301。003。120。500。2250。2000。0400。015炙甘草首煎二煎15。61。725。051。127。801。203。250。620。4750。2250。5920。035四君子汤首煎二煎500。0132。4204。073。0164。050。096。036。45。52。59。243。76注:单味中药的数据表示每克中药中所含元素的量μg/g;方剂中药的数据表示整个方剂中元素总的含量μg从表12-3-10中可以看出,方剂中的每一元素含量绝不是各单味中药各元素含量的简单相加。并且首煎液的元素含量显著优于2煎液中的含量。从测定结果看,四君子汤中铁、锰、锌、铜的含量较高,而这些元素对人体的生长发育,核酸及蛋白质的合成,生殖器的发育,第二性征的出现,血液代谢及内分泌调节,提高机体免疫及抗感染方面均有着至关重要的作用。同时,这些机体必需元素对维持中枢神经系统的构造及生理功能具有重要意义。龚氏等为进一步用现代科学揭示补益方的实质,就《太平惠民和剂局方》和《正体类要》上的四君子汤、四物汤和八珍汤作了微量元素测定。结果表明:3个方中均含较为丰富的微量元素,其中以Fe、Zn、Mn等含量为高;3方比较除Fe(可能还有Ni、Co等外),均以四君子汤中微量元素含量为高,八珍汤次之,四物汤为低。补血方剂四物汤中含铁量高。与现代医学用铁剂治疗贫血的理论相一致。四物汤补血调经的功效,不仅是微量元素Fe的作用,而是多种成分共同作用的结果。Cu、Zn等元素在四君子汤中含量较高,从3个方Cu/Zn比值来看,似乎可以纠正患者血清Cu/Zn比值升高现象。并认为,从微量元素的生物学作用探讨气能生血理论是很有意义的[8]。李氏也对四物汤、四君子汤中微量元素的作用进行了分析研究[9]。另有从补气、补血、气血双补代表方即四君子汤、四物汤、八珍汤中磷脂和维生素含量的分析测定探讨了各方的作用机制[10]。何氏对四君子汤的生物活性与化学成分上进行分析探讨[11]。【药理研究】1。对胃肠道运动的调节作用人参、白术、茯苓、炙甘草各等份,以生药:水=1:3的比例加蒸馏水浸泡10h,然后加热浓缩过滤成100%的药液。取体重200～250g大鼠,雌雄兼用。实验前将大鼠禁食18～24h,自由饮水。实验时用新配制的含活性碳和阿拉伯胶各10%的蒸馏水混悬液(给四君子汤的运动则用四君子汤作溶剂来配制),按1mg/100g体重的用量灌胃。灌胃后15min断头剖腹,取出小肠铺平,测量碳粉混悬液从幽门括约肌推向小肠末端回盲部的距离,并计算这一距离占小肠全长的百分数作为胃肠推进运动的指标。整个过程均采取双盲法(即操作者不了解实验运动的分组情况),实验数据经t值法作统计处理[12]。1。1 对正常大鼠胃肠推进运动的影响取大鼠24只,随机分为对照组和四君子汤组各12只。四君子汤组大鼠灌胃四君子汤4ml/kg,每日早晚各1次,连续3d,饮水吃料照常。对照组灌胃等量生理盐水,二组均于第4天进行实验。结果:对照组大鼠胃肠推进值为47。69±4。63%,四君子汤组为41。55±6。21%,比对照组降低6。14%,差异显著(P<0。05)。说明四君子汤对大鼠胃肠推进有抑制作用[12]。张氏用党参方的四君子汤及其组成药物白术、茯苓、甘草煎剂灌胃(25g/kg),对小鼠小肠炭末推进无明显影响,但党参在6。26～25g/kg剂量有明显抑制作用,同一剂量的四君子汤、党参、茯苓可拮抗新斯的明引起小鼠小肠炭末推进的亢进,白术、甘草则无明显的作用[13]。彭氏用中性红移动率观察了四君子汤对正常小鼠胃肠推进运动的影响,取ICR小鼠30只,随机分3组,常法观察胃肠道蠕动结果。空白对照组中性红移动率为49。3±10。0%,5或20g/kg四君子汤分别为52。6±5。1%及52。5±6。4%,表明四君子汤对正常小鼠胃肠运动无明显作用[14]。1。2 对利血平处理后大鼠胃肠推进运动的影响[12]取大鼠24只,随机分为利血平组和四君子汤加利血平组各12只。两组大鼠均肌肉注射利血平1。0mg/kg,每日1次,连续3d。四君子汤加利血平组大鼠在肌肉注射利血平的同时,灌胃四君子汤4ml/kg×2次/d×3d,利血平组灌胃等量生理盐水。结果:利血平组大鼠胃肠推进值为71。28±4。38%,四君子汤加利血平组为58。12±7。51%,比利血平组降低13。16%,差异非常显著(P<0。01)。1。3 对肌注新斯的明后大鼠胃肠推进运动的影响[12]取大鼠24只,随机分为新斯的明组与四君子汤加新斯的明组各12只。四君子汤加新斯的明组大鼠灌胃四君子汤,方法同前。新斯的明组大鼠灌胃等量生盐水。两组大鼠均在实验时肌肉注射甲基硫酸新斯的明0。1mg/kg,15min后,灌胃碳粉混悬液。结果,新斯的明组大鼠胃肠推进值为65。50±5。39%,四君子汤加新斯的明组为54。49±7。44%,比新斯的明组降低11。01%,差异非常显著(P<0。01)。1。4 对肌注阿托品后大鼠胃肠推进运动的影响[12]大鼠22只,随机分为阿托品和四君子汤加阿托品组各11只。四君子汤加阿托品组灌胃四君子汤,方法同前,阿托品组灌胃等量生理盐水。两组大鼠均在实验时肌肉注射硫酸阿托品0。1mg/kg,10min后,灌胃碳粉混悬液,结果:阿托品组大鼠胃扬推进值为24。26±6。02%,四君子汤加阿托品组大鼠胃肠推进值为22。91±7。09%,比阿托品组仅降低1。35%,无统计学意义(P>0。05)。实验表明,该方对大鼠胃肠推进运动呈抑制性影响。并且,这种抑制作用在经利血平或新斯的明处理过的大鼠表现尤为明显。利血平能耗竭交感神经末梢中的肾上腺能递质,使之对胃肠的抑制作用降低,副交感神经相对偏亢;新斯的明是胆碱酯酶抑制剂,可以抑制组织中的乙酰胆碱酯酶,使乙酰胆碱破坏减少,在局部蓄积增多。因此,用利血平或新斯的明处理过的动物的消化道主要是处于胆碱能神经的优势支配之下。用四君子汤后,这两种方法处理过的大鼠异常增加的胃肠推进运动均受到抑制,说明该方主要是通过对抗胆碱能神经的兴奋作用而产生效应的。阿托品是M型胆碱能受体阻断剂,可以阻断乙酰胆碱的M样作用。用阿托品后,四君子汤对大鼠胃肠推进的抑制作用便减弱,其机制可能是由于阿托品阻断了乙酰胆碱的作用后,四君子汤无法通过胆碱能神经起作用的缘故。综上所述,四君子汤对胃肠推进运动主要呈抑制性影响。并且,推测这种影响是通过拮抗胆碱能神经递质的兴奋性作用而产生的。黄氏等认为消化道的神经支配十分复杂,除胆碱能神经外,还有肾上腺能、肽能及嘌呤能神经等,四君子汤对消化功能的影响也十分广泛,不会仅通过影响胆碱能神经这一条途径起到健脾的作用。1。5 对食醋法脾虚模型小肠推进运动的影响[14]ICR小鼠45只,雌雄均有,随机分成5组,采用食醋法造模,并测量胃肠推进运动功能。结果四君子汤能消除小鼠脾虚症状,促进脾虚小鼠胃肠蠕动,详见表12-3-11。表12-3-11 四君子汤对脾虚小鼠胃肠推进运动的影响(x±s)组别鼠数(只)剂量(g/kg)中性红移动率(%)空白对照组脾虚模型组自然恢复组四君子汤组四君子汤组108999等容积NS等容积NS等容积NS52065。20±9。1543。67±15。78**47。63±10。57**64。00±16。00△71。33±7。37△△与空白对照组比较:* * P<0。01;与脾虚模型组、自然恢复组比较△P<0。05,△△P<0。01四君子汤对胃肠运动的作用,报道颇不一致,胡氏等[15,16]认为四君子汤可抑制胃肠运动,使食物在肠道停留时间延长,利于食物的消化吸收。闻氏等[17]报道,四君子汤能促进大黄脾虚小鼠胃肠运动。彭氏等[14]实验结果表明,四君子汤对正常小鼠胃肠运动影响不大,但能明显提高食醋脾虚小鼠胃肠蠕动。结合胃肠运动生理功能及文献报道,认为,胃肠运动过快过慢均不利于食物的消化吸收,胃肠运动过快,食物在肠道停留时间过短,不利于消化吸收;胃肠运动过慢,缺乏动力,不仅不利于食物的运送、研磨,而且不利于食物与消化液的混合、肠壁的接触,从而影响消化吸收;脾虚动物胃肠运动缺乏动力,胃肠蠕动减弱,加之消化酶活性减弱,小肠吸收功能下降,故而出现腹泻;四君子汤对两种胃肠运动异常具双向调节作用,既能抑制乙酰胆碱、利血平、新斯的明等引起的胃肠运动异常兴奋,又能改善脾虚动物胃肠运动障碍。2。四君子汤对动物消化液、消化酶的影响2。1 四君子汤对小鼠胃液、胃酸、胃蛋白酶活性的影响[14]取ICR小鼠27只,雌雄均有,随机分为空白对照组及四君子汤高低剂量组,分别灌胃生理盐水5ml/kg、四君子汤药液5ml/kg或20ml/kg,连续2d,禁食2h,第3d腹腔注射1%戊巴比妥钠5ml/kg麻醉,常规消毒皮肤,于剑突下沿腹白线开一约长0。8cm的切口,轻轻找出胃,在幽门与十二指肠结合部用缝线结扎,小心避开血管,缝合腹壁切口。4h后处死动物,拆线,开腹,结扎贲门,取出胃,沿胃大弯切开胃,收集胃液于刻度管中,3000r/min离心10min,计算胃液量,用精密pH试纸测定胃酸pH值。采用Mett氏法改进测胃蛋白酶活性。结果,四君子汤对小鼠胃液量、胃酸pH值无明显影响,但能提高胃蛋白酶的活性,详见表12-3-12。表12-3-12 四君子汤对小鼠胃液、胃酸、胃蛋白酶活性的影响(x±s)组别动物数(只)剂量(g/kg)胃液量(ml)胃酸(pH值)胃蛋白酶活性(mm)对照组四君子汤组四君子汤组999等容NS5100。56±0。140。56±0。290。54±0。243。00±0。433。17±0。503。33±0。502。35±0。893。01±0。733。98±0。64**注:与对照组比较:* * P<0。01,胃蛋白酶活性为24h消化1mm毛细玻璃管内凝固鸡卵蛋白的长度2。2 四君子汤对脾虚大鼠胃主细胞内酶元颗粒的影响[14]取SD大鼠50只,雌雄均有,随机分为5组。食醋法造模10d后用四君子汤药液灌胃治疗,分别为3。5ml/kg·d-1、7ml/kg·d-1,连续5d。第16d,在乙醚麻醉下活体取胃组织1块,立即投入3%戊二醛液内固定,常规电镜制片,H-600型透射电镜观察。结果与正常组动物相比,脾虚模型大鼠脾虚症状明显,胃主细胞内酶元颗粒明显减少;自然恢复组大鼠脾虚症状仍见,胃主细胞内酶元颗粒有所增加;经四君子汤治疗后,脾虚症状消失,3。5g/kg组胃主细胞内酶元颗粒明显增加,7g/kg组胃主细胞内酶元颗粒非常丰富。胃蛋白酶原由胃主细胞合成,并以酶元颗粒的形式贮存在细胞内,无活性的胃蛋白酶原分泌入胃后,与盐酸接触转变成有活性的胃蛋白酶。胃液中胃蛋白酶的活性能代表胃液的消化力。四君子汤对胃液量、胃酸pH值无影响,但能明显增加胃主细胞内酶元颗粒的含量,提高胃蛋白酶消化毛细玻璃管内凝固蛋白的长度;提示四君子汤能促进胃蛋白酶原的合成,提高胃蛋白酶的活性,从而提高消化能力。3。四君子汤对动物小肠吸收功能的影响3。1 四君子汤对脾虚大鼠血清D-木糖含量的影响[14]取SD大鼠45只,雌雄均有,随机分为5组,方法同前,第16d,灌胃10%D-木糖10ml/kg,1h后股静脉采血,静置,离心,分离血清,用半自动生化光谱分光分析仪,对溴苯胺比色法测血清D-木糖含量。结果,四君子汤能消除大鼠脾虚症状,明显升高脾虚大鼠血清D-木糖的含量。正常对照组为0。33±0。08mg/ml,脾虚组为0。29±0。07mg/ml(P<0。05),自然恢复组为0。35±0。10mg/ml,3。5g/(kg·d)及7。0g/(kg·d)四君子汤组分别为0。39±0。12mg/ml,0。41±0。14mg/ml,与脾虚组相比P值均<0。05。3。2 四君子汤对脾虚大鼠小肠上皮细胞微绒毛的影响方法同前。第16d,在乙醚浅麻下取空肠组织1块,立即投入3%的戊二醛液内固定,常规电镜制片,H-600型透射电镜下观察空肠吸收上皮细胞微绒毛的形态。结果,空白对照组大鼠空肠吸收上皮细胞微绒毛排列整齐;脾虚模型组大鼠空肠吸收上皮细胞微绒毛肿胀、脱落、数量减少、排列紊乱、表面糖衣减少;自然恢复组大鼠空肠吸收上皮细胞微绒毛仍短、稀疏、脱落、肿胀、排列紊乱;四君子汤小剂量组大鼠空肠吸收上皮细胞微绒毛排列整齐、糖衣丰富;四君子汤大剂量组大鼠空肠吸收上皮细胞微绒毛密集,排列整齐,糖衣丰富。小肠是吸收营养物质的主要场所,小肠吸收上皮细胞微绒毛能增加肠道与食物的接触面积,利于营养物质的吸收。D-木糖已作为比较公认的脾虚特异性指标,四君子汤能升高脾虚大鼠血清D-木糖,增加脾虚大鼠小肠上皮细胞微绒毛,从而增强小肠对营养物质的吸收功能。4。调整小鼠消化功能紊乱的作用[18]选用NIH种雄性小鼠,体重20～25g,鼠龄4周。将小鼠随机分为4组。对照组:常规饲养,以等体积生理盐水代替药物。小承气汤组:每日上午、下午各灌饲小承气汤煎剂1次,每次72g/kg(0。6ml/20g体重),半量进食,自由饮水。小剂量四君子汤组:灌饲小承气汤,剂量和次数与小承气汤组相同,并于上午灌饲小承气汤前1～2h灌饲四君子汤煎剂,11g/kg体重,半量进食,自由饮水。大剂量四君子汤组:动物饲药方法与小剂量组相同,但四君子汤剂量加倍,22g/kg体重。连续给药(或生理盐水)14d后,分别测定小鼠5min自主和站立活动次数,处死前禁食24h,称体重,各组小鼠均灌饲25g/L的葡萄糖溶液(约0。2ml/10g体重),30min后,自眼眶取血,用葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度。颈椎脱臼处死动物后,迅速取出适当肝脏洗净残血,置入预冷的线粒体分离介质中(HEPES缓冲液),用聚四氟乙烯浆器研磨成肝匀浆,按常规方法分离线粒体,Lowry法测定线粒体蛋白质含量,以谷氨酸-苹果酸为底物,用Clark氧电极测定线粒体耗氧量。测氧系统,加200μl新鲜鼠肝线粒体(约5mg蛋白/ml)至反应介质液中,总体积2ml。30℃保温3min后,开始记录耗氧量,加500μmolADP(5μl)至反应体系中,此时耗氧速度明显增加,为呼吸状态3(S3)。当ADP磷酸化形成ATP时,抑制呼吸,耗氧速度降低,称为呼吸态4(S4)。呼吸控制比率是S3/S4比值,以此值表示氧化磷酸化反应效率。取上述各组小鼠肝脏(约0。25g)用预冷的生理盐水洗净表面残血,制备10%肝匀浆,分别吸取1ml匀浆液,各加入1ml 3% HClO4沉淀蛋白,离心3000r/min 10min,取上清液1ml,加入80μl20%KOH,中和至pH7。0左右,置4℃冰箱内30min,使KClO4析出结晶,取上清液10μl用高效液相色谱仪直接测定三种腺苷酸(AMP、ADP、ATP)含量,按下列公式分别计算各组肝细胞能荷值。4。1 四君子汤对小鼠糖吸收和体重的影响[18]各组空腹小鼠口服葡萄糖后,四君子汤组小鼠血糖明显高于小承气汤组(P<0。01),但未见剂量依赖关系,证明四君子汤具有促进糖吸收作用。同时该两组小鼠的体重也明显高于小承气汤组(P<0。01)。小承气汤组小鼠血糖和体重都显著低于对照组(P<0。01)。表12-3-13 四君子汤对小鼠糖吸收和体重的影响(x±s)组 别鼠数(只)剂量(g/kg)血糖浓度(mg/dl)体重(g)喂药前喂药后对照组小承气汤组1120 183±31118±72**22。1±3。022。1±4。524。7±2。020。2±2。6**四君子汤组四君子汤组17171122335±103△△300±67△△23。3±3。223。1±2。726。4±2。3△△26。8±2。0△△注:与对照组比较,* * P<0。01;与小承气汤组比较,△△P<0。0014。2 四君子汤对小鼠自主活动与站立能力的影响[18]四君子汤组小鼠5min自主活动和站立能力均强于小承气汤组,并接近对照组,大剂量四君子汤组优于小剂量四君子汤组,表明四君子汤组通过纠正小承气汤所致的胃肠功能紊乱,促进糖吸收,提供机体自主活动的物质基础(能源)。表12-3-14 四君子汤对小鼠自主活动和站立能力的影响(次/5min,x±s)组 别鼠数(只)剂量(g/kg)自主活动站立活动对照组小承气汤组59 694±16658±26**56±844±9**四君子汤组四君子汤组1181122681±16△△680±3947±454±9注:与对照组比较,* * P<0。01;与小承气汤组比较,△△P<0。014。3 四君子汤对小鼠肝脏线粒体氧化磷酸化反应的影响[18]小承气汤组RCR值显著低于对照组(P<0。01)和小剂量四君子汤组、大剂量四君子汤组(P均<0。01),而后者又接近对照组;说明小承气汤引起小鼠肝脏线粒体RCR值降低,是与胃肠吸收功能下降有关,四君子汤则有保护肝线粒体合成ATP的功能,并呈最效关系,结果见表12-3-15。表12-3-15 四君子汤小鼠肝线粒体氧化磷酸化效率的影响(±s)组别鼠数(只)剂量(g/kg)S3S4RCR([O2]nmol·mg-1蛋白·min-1)对照组小承气汤组912 151。41±31。83113。64±18。9434。03±4。4943。66±4。464。25±0。882。75±0。40**四君子汤组四君子汤组12141122134。74±36。96149。52±40。7738。54±7。3736。17±7。733。44±0。67△△3。77±0。91△△注:与对照组比较,* * P<0。01;与小承气汤组比较,△△P<0。014。4 四君子汤对小鼠肝细胞能荷的影响[18]小承气汤组能荷值低于其他3组,说明小承气汤模型组小鼠ATP水平的调节受到影响,大剂量四君子汤组可明显地调整能荷值,并近于对照组,结果见表12-3-16。表12-3-16 四君子汤对小鼠肝线粒体能荷的影响(±s)组 别鼠数(只)剂量(g/kg)能荷值对照组小承气汤组1010 0。754±0。0370。732±0。080四君子汤组四君子汤组111111220。749±0。0710。759±0。052实验结果说明,四君子汤组小鼠对糖的吸收功能有明显改善,体重增加和自主活动能力增强等,这可缓解气血生成不足所引起的气虚现象。肝脏能量代谢实验包括两项内容:能量(ATP)的生成和能量的调节。四君子汤组小鼠肝线粒体RCR明显高于小承气汤组,尤以大剂量组更为显著。因为小承气汤有耗气破气,损伤胃肠正常功能的作用,加之饥饱失常,两者互为影响,而导致肝脏氧化磷酸化效率降低。RCR是反映线粒体氧化磷酸化功能主要指标:RCR值大,说明偶联能量效率高,能量(ATP)合成增加;反之,偶联效率低,即解偶联占优势,能量合成减少。正常情况下,机体以偶联和解偶联方式不间断地调整着能量动态平衡和温煦四肢维持体温的作用。实验结果说明四君子汤具有调整肝脏线粒体合成能量功能或参与治疗脾气虚证的作用。细胞能荷值是机体组织细胞能量状态的一种参数。正常机体细胞能荷值在0。80～0。95较窄范围内波动,它受生理或病理等多种因素的调节。实验中观察到小承气汤组动物肝细胞能荷值均低于其他3组,说明四君子汤可改善消化功能低下所引起的细胞能荷的平衡失调,这有利于组织细胞代偿性的调节能量转换,以应激维持细胞的正常生理功能。5。对胃粘膜细胞形态学、酶组织化学和胃肠激素的影响按常规煎煮法制备四君子汤、大承气汤煎剂(四君子汤和大承气汤分别含生药量约为100g/L、300 g/L浓缩药液),存于0～4℃备用。将48只雄性大鼠随机分为4组,每组12只。对照组:常规饲养,用等量生理盐水代替大承气汤和四君子汤煎剂。模型组:每日上午(10:00)灌饲大承气汤煎剂50g/kg体重(20 ml/kg体重),半量进食,随意饮水。小剂量四君子汤组:每日上午先灌喂四君子汤煎剂10 g/kg体重,1～2 h后,灌喂大承汤煎剂(剂量同模型组)。大剂量四君子汤组:塑模方法同小剂量四君子汤组,仅四君子汤剂量加倍。各组大鼠连续给药(或生理盐水)15d,处死动物前禁食24 h。脱臼处死大鼠后,参照Lewin方法分离胃粘膜细胞,用pH5。5的柠檬酸缓冲液洗涤,收集分离的混合胃粘膜细胞,制备成悬浮细胞液,涂于玻璃片上,供细胞形态学观察。用Harris法HE染色显示细胞一般形态。以Hanslem法显示碳酸酐酶(CA); Nheas的N-BT法显示琥珀酸脱氢酶(SDH); Whstein和Meisel铅法显示三磷酸腺苷酶(ATPase)和葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)。每组分离的壁细胞计数200个,依据染色反应深浅(表示酶活性强度)分为3级:以正常细胞染色深度为+ +,浅色为+,阴性为-,作分类构成比进行统计学分析。自眼眶取血,肝素抗凝,离心3000 r/ min, 10 min,分离血浆,应用放射免疫分析药盒分别测定胃泌素、胃动素、胰高血糖素3种胃肠激素[19]。5。1 对胃粘膜细胞等形态学的影响易氏[19]分离的胃粘膜细胞包括胃粘膜表面上皮细胞(柱状细胞)和胃底腺上皮细胞(壁细胞、主细胞、颈粘液细胞),经计算1 000个细胞获得它们的平均百分比是:柱状细胞为1。7,腺上皮细胞分别为38。1、55。2和5。0。大承气汤诱发的脾虚模型能见到胃粘膜一些细胞的损伤,尤对壁细胞更为明显,如细胞皱缩、胞膜出现局部缺损和胞质嗜酸性较对照组降低,由红色转为浅暗红色,严重损伤的壁细胞显出空泡化、核浓密。四君子汤组动物显示壁细胞损伤程度较轻,细胞增大,胞质嗜酸性强。陈氏[20]用应激过量和饥饱法经过较长时间造成大鼠脾虚证模型。观察到脾虚大鼠的胃、肠、胸腺、脾脏、肝脏、肾上腺、心脏、卵巢等均发生明显的组织学改变;心、肠、胸腺等的超微结构也发生显著变化。这些器官的病理改变是临床上脾虚证患者出现纳差、腹胀、便溏或腹泻、免疫功能降低及血液系统改变,神经内分泌紊乱的病理基础。以本药加黄芪、陈皮组成加味四君子汤,可促进脾虚大鼠体重、胸腺重、脾脏重、胸腺皮质厚度,空肠腺上皮细胞核分裂数的增加(P<0。01),可促进胸腺、脾脏、胃、肠、心脏等超微结构恢复正常。说明加味四君子汤对脾虚动物胃肠粘膜修复、胸腺及脾脏淋巴细胞数增加有益,也表明对上述器官的线粒体等细胞器的复制有促进作用[25]。彭氏[21]实验也证明四君子汤有抗脾虚动物胃肠细胞损伤的作用,对过劳和饮食失节造成大鼠脾虚模型,用四君子汤灌胃给药,电镜观察发现给药组胃肠粘膜的修复比自然恢复的好[22]。曹氏[23]证明四君子颗粒能改善脾虚症状,纠正胃肠病损,消除细胞变性,坏死脱落的病理变化,恢复细胞、亚细胞、细胞连接的形态,增加细胞表面微绒毛、细胞质颗粒和细胞器的数量。提示四君子颗粒具有胃肠细胞保护及抗脾虚动物胃肠细胞损伤的作用。5。2 对酶组织化学的影响[19]壁细胞酶的组化染色反应明显,易于观察,进行计数比较,经构成比的统计学处理,显示四君子汤可以使大承气汤引起CA和SDH降低的酶活性增强,见表12-3-17,表12-3-18,有统计学意义。虽然ATPase和G-6-Pase活性无明显差异,但ATPase活性有增高的趋势。表12-3-17 四君子汤对壁细胞显示CA染色反应构成比的影响组别剂量(g/kg)CA染色反应合计P值+++-模型组 2810270200 四君子汤组20749630200<0。01*注:*小剂量与大剂量四君子汤组差异不显著,结果未列入表12-3-18 四君子汤对壁细胞显示SDH染色反应构成比的影响组别剂量(g/kg)SDH染色反应合计P值+++-模型组 104951200 四君子汤组20134660200<0。055。3 对3种胃肠激素含量的影响[19]结果见表12-3-19。表12-3-19 四君子汤对3种胃肠激素含量的影响(ng/L)组 别剂量(g/kg)胃泌素胃动素胰高血糖素对照组模型组 58。5±9。9(11)39。9±9。2(10)**249。4±38。0(10)304。4±37。7(10)**#403。9±33。5(9)451。2±57。6(10)*#四君子汤组四君子汤组102044。2±11。0(10)**49。1±12。0(10)277。0±24。0(10)266。0±22。6(10)406。7±62。9(10)397。8±49。9(10)注:与对照组比,* P<0。05,* * P<0。01;与大剂量四君子汤组比# P<0。05由表12-3-19所示,模型组和小剂量四君子汤组动物胃泌素均低于对照组(P<0。01),但两种剂量的四君子汤组均高于模型组,尤其大剂量四君子汤组与对照组接近。模型组的胃动素和胰高血糖素均高于对照组(P<0。01,P<0。05)和大剂量四子君汤组(P<0。05),大剂量四君子汤组亦优于小剂量四君子汤组并接近对照组。实验结果发现模型组大鼠胃粘膜细胞形态受损,尤以壁细胞明显,同时其CA、SDH和ATPase活性降低,胃泌素亦降低,但胃动素和胰高血糖素则有增加趋势,四君子汤组动物上述各项指标均有明显改善并接近对照组。模型组动物由于苦寒泻下的大承气汤加以饥饱失常,诱导胃肠功能紊乱,生物膜流动性降低,CA和SDH活性下降,伴随胃酸分泌减少,减弱对食物的消化作用。脾虚证时,由于脾失健运所致的消化系统以及机体整体功能紊乱,因而出现神疲、乏力、倦怠、便溏以及胃粘细胞形态损伤、酶活性低下及某些相关的胃肠激素分泌失调等症,而四君子汤能在一定程度上阻抑大承气汤对机体的损伤作用及过度的胃肠蠕动,保护胃粘膜细胞,有利于对营养物质的吸收,此可能与白术、茯苓直接松弛平滑肌,使收缩幅度减少,张力下降或降低胃动素分泌有关。结果提示,四君子汤剂进入胃部组织已开始发挥药物作用,可能通过保护胃粘膜细胞,调整紊乱的胃肠激素,促进胃肠道对葡萄糖的吸收,继之提供肝脏代谢功能的物质基础,从而发挥对机体的整体补益效应。6。对胃肠激素和代谢的影响任氏从分子生物学角度探讨四君子汤健脾的机制。用利血平造成脾虚证大鼠模型,用放射免疫分析(RIA)测定发现其血浆和近段空肠组织胃动素(MOT)的含量明显下降,降结肠和直肠组织前列腺素E2(FPE2)的含量明显升高。MOT的主要功能是影响胃肠道的运动功能。在消化间期MOT呈周期性释放;引起胃和小肠产生IMCⅢ相,并诱发胃强烈收缩和小肠明显的分节运动,其生理意义,可能是对胃肠腔的内容物起着一种清扫作用。PGE2对肠道平滑肌有很强的收缩作用,可使肠蠕动加快,并能抑制肠腔中水和电解质的吸收,刺激肠液分泌。脾虚患者的纳差、腹胀及消化不良与患者上段小肠的MOT水平下降有关;而腹泻、肠鸣与大肠中PGE2的水平升高有关。四君子汤每日4g/只,连续灌胃14d可明显提高模型大鼠的血浆和上段小肠MOT含量,降低其大肠中PGE2的含量,提示四君子汤的益气健脾作用与其调整胃肠激素失衡有关[24]。郭氏用大鼠70只,复制大鼠烫伤模型,随机分为3组,烫伤治疗组于伤后12h开始管饲四君子汤加味,烫伤对照组和假伤组管饲蒸馏水。结果,四君子汤可明显降低烫伤大鼠血浆和肠粘膜TNT、NO和MDA含量。表明四君子汤对减轻烫伤后肠粘膜的损伤应有积极的作用[25]。宋氏[26]研究了不同时辰四君子汤治疗“脾虚证”大鼠血清胃泌素昼夜节律性的变化规律。7。对肠菌失调胃肠功能的影响[27]四君子汤由党参、白术、茯苓、甘草等组成,3次煎液混合浓缩至含生药100%的药液,实验时用蒸馏水配成所需浓度;大黄3次煎液混合浓缩至含生药100%药液。7。1 对肠道菌群紊乱的治疗作用小鼠64只,其中48只每日灌胃大黄药液1g/只,所余16只同时每日灌胃等容量蒸馏水,均连续给药8d,此后,将灌大黄小鼠随机分为四君子汤高剂量组(20g/kg·d),低剂量组(5g/kg·d)、模型对照(等容量蒸馏水),将灌蒸馏水小鼠作正常对照组(等容量蒸馏水)。随即,各组动物每日灌胃给予相应药物或蒸馏水1次,连续5d,无菌条件下剖开腹腔,采集肠道内成型粪便。用双歧杆菌和乳酸杆菌液培养基分别将粪便稀释成10-7浓度,各取0。1ml分别接种于双歧杆菌和乳酸杆菌固体培养基上,厌氧条件下37℃培养72h,记数双歧杆菌和乳酸杆菌菌落数。实验数据采用t检验处理。结果模型对照组双歧杆菌(×107/g粪便),乳酸杆菌(×107/g粪便)4。44±2。42、6。07±1。00,正常对照组为14。56±2。45和29。69±10。28,四君子汤剂量组为7。44±2。42(P<0。01),13。69±3。80(P<0。001),低剂量组分别为6。75±2。77(P<0。05),10。50±3。32(P<0。01)。7。2 对肠道菌群紊乱的预防作用小鼠64只,组别、药物、给药量及给药途径同上,除正常对照组每日灌胃给予等容量蒸馏水外,其余3组运动每日灌胃大黄药液1g/只,均连续8d。在此期间,从第4d开始,各组动物均同时加用相应药物或蒸馏水等至第9d。停药日处死动物,照前述方法取小鼠粪便、培养和记数。结果模型对照组双歧杆菌(×107/g粪便),乳酸杆菌(×107/g粪便),分别为1。00±0。78、4。79±2。90,正常对照组12。75±2。59、26。81±5。88;四君子汤高剂量组为2。36±0。84、14。24±1。53,低剂量组分别为2。28±0。48、16。62±5。30,给药组与模型组比较P均小于0。01。双歧杆菌和乳酸杆菌系肠道内的优势菌群,其对维护机体的健康具有重要的意义。小鼠灌胃给予大剂量的大黄水煎液制造动脾虚模型,可引起肠道菌群紊乱,其中双歧杆菌和乳酸杆菌菌量明显减少。四君子汤为中医治疗脾虚的经典方药,脾虚模型小鼠用药后,对双歧杆菌和乳酸杆菌具有明显的增菌作用,从而调节肠道菌群失调,此作用可能系其临床治愈脾虚的药理作用基础之一。另有多篇报道,进行了加四君子汤对类脾虚小鼠的作用研究[28]、四君子汤单味药对动物离体小肠运动的响[29]、四君子汤与红芪建中汤对大黄合剂复制小鼠,“脾虚”模型的作用对比[30]、以及用四君子为基础加味组方制成健儿散后和四君子汤对正常或大黄致脾虚动物体重的对比研究[31]。8。对离体平滑肌运动的影响本药对动物离体肠管运动具有明显的抑制作用。实验表明,用药后正常家兔离体十二指肠紧张性下降,收缩幅度减小;对Ach-氯化钡引起的家兔离体回肠强直性收缩有抑制作用,对前者的抑制较后者强,其抑制率分别为83%和26%;在离体豚鼠回肠上,对氯化钡、组胺的抑制率分别为27%和65%;对于肾上腺素所致的家兔十二指肠和豚鼠回肠收缩抑制,本药反而使收缩振幅度加大。上述结果表明本药对肠道运动的影响主要与其Ach及组胺有关,对平滑肌的直接作用较弱。还可看出,本方还能调整病理状态下肠管运动功能,使亢进者抑制,抑制者兴奋,呈现双向调整作用。朱氏亦对家兔离体小肠进行实验观察,结果表明本方可使正常小肠张力降低,但振幅增加;对Ach引起强直性收缩的抑制率为87%,但对抗肾上腺素的作用效果不明显。白术亦能对抗Ach及肾上腺素的作用[32]。离体平滑肌试验表明,该方煎剂对家兔十二指肠自发活动呈抑制性影响,可拮抗乙酰胆碱引起离体小肠的强直性收缩,对氯化钡的拮抗作用较弱,但抗组胺作用显著,也能部分解除肾上腺素所致肠管的抑制[33]。本方还能降低利血平化小鼠回肠对乙酰胆碱的异常反应性,使其恢复至正常水平[34]。本药的不同提取物对家兔离体肠管收缩运动的作用趋势是一致的,即表现为抑制离体小肠的自发收缩运动,拮抗Ach或氯化钡所致的肠管强直性收缩。但其各个不同提取部位的药理作用强度有所不同,以醇提取为最佳。以乙醇或水提取后,再经正丁醇萃取,萃取液的药理作用较强,认为其药理活性成分为中等极性物质;而各不同提取部位的物质,均未发现有拮抗肾上腺素所致离体肠管的抑制作用。实验表明,本药乙醇提取正丁醇萃取物,基本上能代表本药对离体肠管收缩运动的作用[15]。四君子汤也可抑制由钡离子所引起的肠管运动,但对抗氯化钡的作用较弱,亦即直接作用于平滑肌的作用较弱。同时发现,四君子汤抗组胺的作用较强,100%四君子汤1。0ml对组织胺的抑制百分率为65%(P<0。05)。结合临床,一部分慢性过敏性腹痛腹泻患者,服用本方可通过抗组胺而发挥疗效[32]。9。对胃肠肌电的影响9。1 对利血平脾虚模型在体胃肠肌电的抑制作用[35]选择体重250～400g健康豚鼠,雌雄不限,随机分为脾虚组、对照组、治疗组和自然恢复组,每组10只动物。对每组动物观察用药前后体重、症状、体征和在体胃肠肌电的变化。脾虚组和对照组分别经腹腔注入利血平注射液(0。4ml/kg体重/d)和蒸馏水(0。4ml/kg体重/d)。连续注射4d。第5d记录。记录前,禁食18～24h,用20%乌拉坦(7ml/kg体重),腹腔注入麻醉后,开腹详细观察各段肠管充盈状态、颜色及运动情况。同时描记胃、回肠、结肠和盲肠的肌电活动。纸速2。5～5mm/s,时间常数胃为2s,其他部分均为0。1s,滤波15Hz。腹腔胃肠均浸没在温台氏液中,动物体温维持在37℃左右。治疗组和自然恢复组:两组动物在连续4d注射利血平后,分别经胃灌入100%四君子汤煎剂和自来水,各5ml,每日2次,连续7d,用上述方法,观察体重、症状及描记胃肠四个不同部位的肌电变化。全身症状和体征:脾虚组动物在注射利血平第2 d后,即出现饮食下降、逐渐消瘦,先后出出软便,个别出现水样便。活动减少,反应变钝,全身发抖、畏寒,个别动物出现震颤、眯眼、嘶叫声变低,四肢及腹部肌力减弱,腹部仰卧外观呈现舟状腹。剖腹安放吸引电极前,首先可见各段肠管蠕动明显加快,继而逐渐减慢。胃、空肠、结肠、盲肠内容物缺失,各肠段失去了肠内容及粪便充盈时的自然分界的颜色,表现均匀一致的粉红色。对照组在注射等量的蒸馏水后,饮食正常,成形粪便,行走迅速,反应灵敏,睑裂正常,嘶叫声尖调高,腹肌和四肢肌肉挣扎时有力,剖腹时可见各段肠管运动缓慢,各段均被肠内容或粪便充盈,呈现自然可辨的颜色:十二指肠、空肠为粉红色,回肠、结肠为灰褐色、盲肠为蓝黑色。体重变化:脾虚组动物注射利血平后,体重出现逐日明显下降(P<0。01),对照组注射前后体重没有明显变化(P>0。05)。治疗组和自然恢复组在治疗期间体重略有增加,但无统计学意义(P>0。05)。在体胃肠肌电的变化:由正常的豚鼠胃肠道平滑肌一般可记录到两种型式的肌电活动,一种为基本电节律,又称慢波;另一种是负载在慢波之上频率较快的锋电活动,又称快波。用本方法,在胃部只记录到慢波,而在其他3个部分能观察到这两种型式的电活动。除在胃和结肠能记录到规律性的慢波外,在各段肠管都可记到不规律性的慢波和快波。对慢波的作用:在脾虚组和对照组胃和结肠所记录到的规律性慢波的平均频率和振幅之间比较,没有明显差别。见表12-3-20。结果提示在脾虚组动物慢波变化不大。表12-3-20 脾虚组和对照组豚鼠胃和结肠慢波的比较(±s)部位参 数脾虚组对照组P值胃平均频率(次/min)平均振幅(μv)6。64±1。523121。24±2126。807。33±1。373478。28±2291。90>0。05>0。05结肠平均频率(次/min)平均振幅(μv)18。24±3。45223。4。66±1277。3617。28±1。222152。42±1252。12>0。05>0。05对快波的作用:利血平致脾虚后豚鼠的快波变化较为明显,可使各段肠管快波出现率增加。在对照组动物的回肠、结肠、盲肠所记录的快波出现率较少,但在脾虚组则使快波出现率明显增高(P<0。01)。表12-3-21。表12-3-21 对照组和脾虚组不同部位快波出现率的比较部位对照组(%)脾虚组(%)χ2值P值回肠结肠盲肠4。2610。0033。3353。0641。8271。7027。6213。5515。35<0。01<0。01<0。01此外,利血平对脾虚豚鼠的快波频率及振幅也有明显影响。在对照组快波的平均频率和平均振幅都较低,而脾虚组快波的平均频率及振幅均明显增加(P<0。01)。见表12-3-22。四君子汤对动物体征及胃肠肌电的影响:治疗组与自然恢复组运动比较,脾虚诸证消失较快,如饮食增加,便型转为正常,活动增多,发抖减轻,肌力增加,嘶叫声变为有力,体重开始回升,剖腹时可见各段肠管蠕动减慢,肠腔充盈,各段颜色分明。其中胃肠的肌电首先恢复,而体重和肌力恢复最慢。用四君子汤对脾虚后的豚鼠进行治疗,结果发现四君子汤可使致虚后的动物回肠、结肠增加的快波出现率显著下降(P<0。01),盲肠的快波出现率也出现减少(P<0。05)。四君子汤对脾虚后豚鼠的回肠、结肠的快波平均频率及平均振幅也有明显降低作用(P<0。05),对盲肠的频率和振幅作用不明显(P>0。05)。表12-3-22 对照组和脾虚组不同部位快波的比较部位参数χ2值P值回肠平均频率平均振幅24。5026。76<0。01<0。01结肠平均频率平均振幅14。7115。59<0。01<0。01盲肠平均频率平均振幅23。3526。45<0。01<0。019。2 对利血平脾虚模型小肠移行性肌电复合波(MMC)的影响陈国志等以小肠移行性肌电复合波(MMC)为指标,观察脾虚大鼠运动变化及加味四君子汤对其作用的效应(加味四君子汤由四君子汤加黄芪、陈皮组成)。小肠MMC是指在清醒状态下禁食15～24h记录出的电活动,它由四个时相组成:Ⅰ时相指重迭快波的慢波数少于5%,与之对应的是小肠运动处于相对静止状态;Ⅱ时相指重迭快波的慢波数大于5%而小于95%,与之对应的小肠运动是不规则的收缩活动;Ⅲ时相指重迭快波的慢波数在95%～100%,此时相小肠运动为规则的节律性收缩;Ⅳ时相与Ⅱ时相相同,但正常大鼠小肠有时不出现Ⅳ时相。四个时相持续时间分别为3。0～4。0,3。0～6。0,2。5～4。0,0。5～1。0min,顺序发生,周而复始的规律出现。大鼠小肠MMC的周期一般在10～15min。利血平致脾虚大鼠的小肠MMC周期的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ时相持续时间缩短或消失,Ⅱ时相及周期明显延长,表明小肠运动功能发生紊乱,可能与利血平增加小肠组织中Ach含量而导致植物神经功能紊乱有关,可能是脾虚动物便溏或腹泻的原因之一。加味四君子汤明显促进脾虚大鼠小肠MMC各时相周期恢复正常或接近正常,具有调节小肠运动功能紊乱的作用,此作用可能与调节植物神经功能有关。实验结果还表明加味四君子汤的作用效应以空肠最好,十二指肠次之,其原因有待进一步研究[36]。9。3 对辐照致脾虚模型小肠移行性肌电复合波的影响在麻醉大鼠的十二指肠、空肠及回肠的肌层上各埋植一对铂金丝针状双电极,术后7d开始实验。首先记录正常大鼠小肠MMC,然后经60Coγ线1次全射照射8Gy(剂量率104。8伦/min)。照射后将动物随机分为治疗组(7只)与对照组(9只)。治疗组照射后即时、1、2、3d予加味四君子汤1。6g/kg灌胃,每天1次;对照组予等量蒸馏水灌胃。记录照射当天、1、3、5、7d的小肠MMC,每次记录前禁食16～24h,记录60min。时间常数0。01s,高频滤波10Hz。加味四君子汤对8Gy照射大鼠小肠MMC的影响:结果见表12-2-23,表12-3-24,表12-3-25。与照射前比较,对照组大鼠在照射后前3d小肠呈兴奋状态,表现在:绝大多数动物的小肠MMC周期消失,以Ⅱ时相代之:个别出现MMC周期的大鼠也是Ⅱ时相明显缩短(P<0。05)、周期数增加;在某些大鼠的Ⅱ时相中有分节律出现。从第3d以后存活的大鼠MMC周期全部消失,仅有Ⅰ和Ⅱ时相,这时大部分动物出现严重的腹泻,发生率93%;治疗组大鼠在照射后前2d小肠亦呈兴奋状态,与对照组相似。但从第3d以后存活的部分大鼠仍然出现MMC周期,除十二指肠的Ⅱ时相与照前比较仍有差别(P<0。05)外,其他已基本正常。腹泻的大鼠明显减少,发生率60%。这表明加味四君子汤能促进缺乏MMC的小肠恢复正常,能调整小肠的运动功能[37,38]。表12-3-23 加味四君子汤对8 Gy照射大鼠十二指肠MMC各时相及周期持续时间的影响(min,±s)组别鼠数MMC期持续时间ⅠⅡⅢⅣ对照照前 93。9±0。2(4)15。5±4。7(33)2。6±0。7(27)0。6(1)11。9±4。5(21)照后1h1d9[3]9[1]2。4±0。9(6)-6。3±2。7(20)*14。7±2。7(4)3。1±0。6(19)1。7±0。7(3)0。6±0。3(3)-9。4±1。8(5)18。4±1。8(2)3d5d7360(1)60±0(2)60±0(6)60(1)------7d1-60(1)---治疗照前 61。6±0。2(4)9。8±2。8(29)2。4±0。5(26)0。6±0。3(3)10。4±3。6(20)照后1h6[3]-21。2±17。4(7)2。8±0。6(6)-9。8±2。3(3)1d660(1)60±0(5)---3d5d7d6[2]6[2]1---37。5±27。6(5)*26。7±11。2(2)*60(1)1。7±0。1(4)2。1±0。6(2)----15。6±1。8(2)37。0±4。5(2)**-注:与本组照前比较,*P<0。05,**P<0。01;[]:出现MMC周期动物数;():出现次数表12-3-24 加味四君子汤对8Gy照射大鼠空肠MMC各时相及周期持续时间的影响(min,±s)组别鼠数MMC期持续时间ⅠⅡⅢⅣ对照照前 93。2±1。3(11)10。0±4。2(41)3。1±0。5(35)-15。8±5。8(26)照后1h1d3d5d7d9[3]9[7]6312。5±0。4(17)3。1±0。9(16)60(1)--3。5±0。9(20)*11。9±7。4(31)60±0(5)60±0(3)60(1)3。9±1。0(18)2。7±0。7(26)---0。6(1)----8。8±1。3(15)12。7±1。9(20)---治疗照前 72。5±1。0(15)9。5±4。2(29)2。9±0。6(29)0。6±0。2(5)14。5±5。1(26)照后1h1d3d5d7d7[3]7[4]6[2]6[1]12。4±0。6(6)1。8±0。1(6)-2。9±1。3(2)-14。7±12。4(11)14。5±9。1(6)18。8±12。3(7)9。9±3。7(4)60(1)2。8±0。5(10)2。3±0。4(15)2。2±0。4(6)3。3±0。3(4)-0。5±0。2(5)0。9±0。3(2)---13。0±5。5(8)14。4±6。8(11)12。0±5。2(4)13。4±1。5(3)-注:与本组照前比较,*P<0。05,**P<0。01;[]:出现MMC周期动物数;():出现次数表12-3-25 加味四君子汤对8Gy照射大鼠回肠MMC各时相及周期持续时间的影响(min,x±s)组别鼠数MMC期持续时间ⅠⅡⅢⅣ对照照前 53。5±1。2(2)25。2±5。3(12)5。8±1。7(7)0。7(1)23。0±11。9(5)照后1h5[2]-7。8±1。2(11)*3。0±1。1(9)-10。2±5。2(6)1d3d5[2]45。6±1。7(2)-24。3±2。2(4)60±0(4)4。1±0。2(4)---32。0±6。3(2)-5d7d3160(1)60(1)60±0(2)-------治疗照前 30。8(1)20。5±6。2(8)3。2±0。3(7)0。8±0。2(2)29。4±11。9(5)照后1h3[1]-18。4±16。1(3)2。8±0。5(2)-13。1(1)1d3d5d3[2]3[1]1[1]13。2±8。8(2)--18。3±7。8(4)26。0±0。1(2)18。1±12。5(2)3。3±0。7(4)3。1±0。1(2)2。5±0。1(2)---35。2±2。9(2)28。9(1)15。3(1)7 d160(1)----注:与本组照前比较,* P<0。05,* * P<0。01;[]:出现MMC周期动物数;():出现次数10。对营养代谢的影响李氏[39]观察了四君子汤、香砂六君子汤、古汉养生精、五氏培元固本丹四种方剂对能量生成的影响。以大鼠小肠葡萄糖转运电位(PD)的方法研究了四君子汤对小肠粘膜上皮细胞葡萄糖转运系统的影响,结果表明,以大黄致脾虚大鼠和以饥饿方法造成的气虚大鼠,其PD明显受到抑制,而四君子汤则有促进PD恢复的作用,揭示脾虚与气虚时上皮细胞Na+泵的转运受到阻抑,而四君子汤则有促进其恢复的作用[40]。实验也发现上述因素大鼠“脾气虚”的动物,其骨骼肌贮存能源物质减少,能量供应不足,线粒体及氧化酶异常减少以及无氧酵解酶活性异常升高的变化。而在造模的同时,每日口服四君子汤(5。75g)的大鼠,投药2周后可纠正上述变化。动物表现为进食量大、体重增长快。肌细胞化学成分也有所不同,表现四君子汤组其肌糖原含量的过碘酸-雪夫(PAS)染色反应的颜色较自然恢复组加深,尤其以Ⅰ型纤维明显,定量研究结果表明Ⅰ型和Ⅱ型的含量均较自然恢复组高;显示肌脂类的油红O染色,四君子汤组也较自然恢复组深,定量表明四君子汤组ⅡA和ⅡB型纤维的脂类含量明显增高,Ⅰ型纤维无明显差异:反映三羧酸循环情况的琥珀酸脱氢酶(SDH)硝基四氮法反应较自然恢复组强,Ⅱ型纤维尤为明显;作为反映细胞色素氢化酶(CCO)的偶联法反应与上述SDH变化结果相一致。四君子汤组的ATP含量较自然恢复组增高。超微结构和电镜组化观察表明,四君子汤组骨骼肌结构接近正常,结构异常的线粒体较少,线粒体的SDH反应较自然恢复组强[41]。本方煎剂可提高小鼠肝糖原的含量[42]。实验表明限制饲料小鼠,其肝重、肝脏系数、肝脏RNA含量均较正常对照组明显下降,而加用四君子汤则有明显的改善[43],四君子汤加黄芪煎剂能提高大黄“脾虚”动物模型肝脏合成RNA的能力[44]。阮氏对烧伤豚鼠早期代谢营养的观察,发现四君子汤能促进代谢有利于烧伤的愈后[45]。11。保肝作用对肝脏的修复作用,由四君子汤加补骨脂、五味子、肉豆蔻等组成的益气健脾方,分别制成注射液和煎剂,按3g/100g体重给大鼠灌胃或皮下注射,对四氯化碳造成的慢性肝损伤有明显的保护作用,并能使坏死区较快得以修复。给药组的血清谷丙转氨酶(SALT)接近正常,较肝损病理组明显降低(P<0。01),肝糖原含量无明显减少。用体外试管法实验显示,本方对HBsAg有一定的抑制作用,其抑制滴度为1:2～1:512[46]。控制饲料对小鼠造成肝脏组织萎缩,即脾虚性肝损伤,然后喂饲四君子汤,与对照组比较,发现肝组织的重量明显增加,而核酸含量无明显变化。肝重增加可能是由于四君子汤促进了小鼠的肝糖原合成,而肝糖原的大量贮存增强了肝脏的解毒功能,并可防止或减轻肝细胞受损后发生的病理变化,有利于肝功能的恢复。当大鼠在跑步机上跑步造成过劳,并用猪油灌胃使其饮食失节时,肝脏的线粒体在超微结构上发生了一定的改变,表现为线粒体嵴的大部分或全部消失。给这种模型的大鼠服用四君子汤,可使线粒体嵴数增多,并且结构清晰,排列整齐,不给药待其自然恢复,则速度较慢[47]。说明四君子汤可促使受损肝脏线粒体的修复,使细胞的能量代谢趋于正常,这对肝病的治疗有重要意义。12。补血作用取SD雄性大鼠分成5组(正常组、贫血模型组、治疗组:四君子汤、四物汤、八珍汤组),贫血模型组与治疗组均于实验的第1、4、7d经皮下注射2%N-乙酰苯胼生理盐水溶液,首次剂量为20mg/100g体重,以后2次注射剂量减半,治疗组动物于实验第1d开始,每日灌胃给予四君子汤、四物汤、八珍汤,1ml/100g体重,对照组和贫血模型组灌服生理盐水,剂量同上,于第11d给药后1h,测定血红蛋白含量、红细胞数、白细胞数,并从腹主动脉取血2～3ml,3000r/min,离心10 min,取血清,进行湿法硝化,于电感耦合等离子体发射光谱仪上测定血清中微量元素,结果见表12-3-26、表12-3-27。表12-3-26 四君子汤、四物汤、八珍汤对溶血性贫血大鼠的血液学指标影响(±s) 动物数正常组贫血组四君子汤组四物汤组八珍汤组Hb(%)RBC(百万个/mm3)WBC(千个/mm3)10101014。50±1。757。44±0。713。94±1。576。25±0。80△△3。26±0。35△△7。52±2。43△△9。96±1。26*7。22±0。94*7。44±1。436。65±0。773。71±0。947。96±1。778。18±1。50*6。03±1。12*7。18±1。73与正常组比较:△△P<0。01;与贫血组比较* P<0。05表12-3-27 四君子汤、四物汤、八珍汤对贫血大鼠的血清TE影响(±s)元素正常组贫血组四君子汤组四物汤组八珍汤组AlAsBBaCaCrCuFeKLiMgMnMo1。62±0。510。04±0。030。11±0。130。21±0。2293。24±7。100。03±0。011。45±0。226。98±1。03708。63±82。430。02±0。0129。30±5。090。01±0。010。03±0。010。73±0。40△△0。05±0。040。18±0。190。57±0。6984。66±3。00△0。02±0。01△2。33±0。34△△8。62±1。14△△290。71±38。81△△0。004±0。004△△26。44±1。820。02±0。020。052±0。016△1。35±0。30*0。05±0。030。11±0。050。45±0。1489。38±5。50*0。03±0。01*1。63±0。18*7。35±1。11*262。15±10。830。01±0。006*22。37±1。43*0。005±0。0150。05±0。020。84±0。090。09±0。070。24±0。160。19±0。2489。17±2。440。02±0。012。16±0。308。39±1。32270。81±17。710。004±0。00724。53±2。120。03±0。030。053±0。0161。11±0。17*0。01±0。020。15±0。120。27±0。2988。83±5。70*0。02±0。011。81±0。51*7。67±1。25300。92±39。500。015±0。011*22。91±3。52*0。005±0。010。03±0。014续表元素正常组贫血组四君子汤组四物汤组八珍汤组NaPPbSeSiSrVZnZn/Cu2804。63±36。42104。24±14。090。035±0。0370。065±0。0663。51±3。080。077±0。0210。018±0。0031。86±0。271。32±0。243032。80±81。33△△94。36±12。850。068±0。0550。071±0。0580。62±0。18△0。076±0。010。008±0。004△△1。87±0。280。81±0。10△3005±45。6886。69±7。660。011±0。018*0。064±0。0891。55±1。290。057±0。014*0。018±0。007*1。63±0。141。004±0。056*3038。5±27。9386。72±5。800。072±0。040。123±0。0791。59±0。740。078±0。010。009±0。0041。69±0。140。79±0。11*3047。1±104。7292。82±10。650。002±0。006*0。042±0。0441。54±1。090。063±0。025*0。014±0。011。64±0。390。92±0。12*与正常组比较:△P<0。05,△△P<0。01;与贫血组比较:* P<0。05从表12-3-26可以看出,贫血大鼠经四君子汤、四物汤、八珍汤治疗后,其中以四君子汤补血作用最好,八珍汤次之,四物汤较差。从表13-3-27可以看出,贫血大鼠血清中微量元素含量较正常组为低,经四君子汤、四物汤、八珍汤治疗,以四君子汤改善作用最强,八珍汤次之,四物汤较差,且从血清Zn/Cu比值来看,亦是以贫血模型组为低,经补气,气血双补后均有所改善。实验研究表明,表于溶血性贫血大鼠的治疗以补气为优,气血双补次之,单纯的补血较差[48]。另有报道以失血造成家兔贫血模型,观察四君子汤的作用,结果表明四君子汤和四物汤组成的八珍汤组其红细胞数、血红蛋白、网织红细胞的增长率较对照组提高;对血压的影响,四君子汤可明显升高失血性家兔模型的血压,给药1～2h升压作用最为显著,升压作用持续12h以上[49]。大鼠灌服该方煎剂1周后,可见动物红细胞生成功能增强,能量代谢明显升高[50]。能提高CY所抑制的骨髓细胞数,以四君子汤为优。提示有形之血生于无形之气的中医气血理论是有科学依据的[51]。四君子汤可克服SCM中抑制物质(或因子)的抑制作用,而促使CSFs分泌,提高循环CSFs水平,进而刺激骨髓造血功能,刺激粒/单核巨噬细胞系及多向性骨髓祖细胞增殖,加速细胞生成、成熟或释放[52]。13。抗缺氧作用[53]13。1 对常压小鼠缺氧的作用取健康小鼠20只,雌雄各半,体重20～25g,对照组给予生理盐水,实验组给予100%四君子汤,以口服给药0。2ml/10g,连续给药7d。最后1次给药15h后,放入250ml广口瓶密闭(瓶内放钠石灰10g,每瓶放入2只小鼠,总体重相近),观察小鼠存活时间,以呼吸停止为指标。结果显示,对照组存活时间为18。1±1。8min。四君子汤组为23。5±4。2min,P<0。01。13。2 对亚硝酸钠中毒致小鼠缺氧的作用取体重22～25g小鼠20只,分对照组和给药组,给药方法同上。末次给药15h后,两组均腹腔注入2%亚硝酸钠溶液0。1ml/10g,观察小鼠存活时间。结果表明,对照组存活时间为9。9±3。5min,四君子汤组为17。2±6。2min,P<0。01。13。3 对异丙肾上腺素致耗氧增加的小鼠缺氧的作用小鼠20只,体重22～25g。给药方法同前,末次给药15h后,腹腔注射异丙肾上腺素0。075ml/10g,15h后,放入广口瓶内密闭,观察小鼠存活时间。对照组为9。2±3。0min,给药组为13。8±3。3min,P<0。01。13。4 抗氰化钾中毒致小鼠缺氧的作用小鼠18只,体重22～25g,分为2组,给药方法同前。末次给药15h后,小鼠腹腔注入0。1%氰化钾溶液0。1 ml/10 g,记录小鼠存活时间。结果显示,对照组为2。7±0。8 min,四君子汤组为3。9±0。9 min, P<0。05。13。5 抗结扎颈总动脉致小鼠缺氧的作用取体重22～25 g小鼠18只,给药方法同前,末次给药15h后,乙醚浅麻醉,手术结扎两侧颈总动脉,术中保持无出血,观察小鼠存活时间。结果表明,对照组为1。8±1。2 min,四君子汤组为3。7±2。3 min, P<0。01。14。抗衰老作用14。1 抗氧化作用将小鼠随机分为中药组(四君子汤合六味地黄丸组)、维生素E对照组和空白对照组。每组动物10只。中药组每只小鼠每克体重给药为0。02 ml,维生素E对照组小鼠每克体重给药为0。02 mg,空白对照组每只小鼠以0。5 ml的生理盐水灌胃,3组小鼠均每日给药1次,并自由取食饮水。3组小鼠分别灌胃10d,然后将动物移人体积为6m×6m×2。8m的相对密封的室内进行紫外线辐射,辐射强度为40瓦特,距离1m,每日1次,每次40 min。辐射期间仍继续给药,实验共20 d。到第21 d处死所有小鼠,并检测各组小鼠肝、脑、肺组织中的IPO含量和SOD活力。LPO含量测定用紫外分光光度法,SOD活力测定采用邻苯三酚法。统计学检验用t检验。结果见表12-3-28、表12-3-29。表12-3-28 四君子汤等对紫外线辐射小鼠肝、脑、肺组织中LPO含量的影响(μmol/g蛋白质)(±s)分组动物数(只)肝脑肺四君子合六味地黄丸组维生素E对照组空白对照组1010100。071±0。001**0。071±0。003**0。075±0。0020。171±0。004*0。182±0。0090。179±0。0070。175±0。003*0。174±0。005**0。182±0。006与空白组比较:* P<0。05,* * P<0。001表12-3-29 四君子汤等对紫外线辐射小鼠肝、脑、肺组织中SOD含量的影响(μmol/g蛋白质)(±s)分组动物数(只)肝脑肺四君子合六味地黄丸组维生素E对照组空白对照组1010105381±505**4492±6414610±3023543±951**3346±1319*2239±8024380±162**1942±5222168±154与空白组比较:* P<0。05,* * P<0。01实验结果可见,四君子汤合六味地黄丸煎剂,能较明显地降低小鼠肝、脑、肺组织中LPO含量,与空白组对照比较有显著性差异;而与维生素E组对照,除在降低肝、肺组织中LPO含量作用方面两者间无显著性差异外,在降低脑组织中LPO的含量方面,中药组的作用明显优于维生素E组。在对SOD活力的作用方面,四君子汤合六味地黄丸煎剂能明显提高小鼠肝、脑、肺组织中SOD活力,与空白组对照比较有显著性差异,而且在提高肝、肺组织中SOD活力的作用方面还优于维生素E组。从实验结果可以发现,维生素E虽然能直接阻断OFR对肝、肺组织的氧化损伤,但在提高SOD活力的作用方面效果较差;其在肝、肺组织中的SOD活力甚至低于空白组。四君子汤合六味地黄丸煎剂的作用可能在于能通过激发机体本身产生大量的SOD样作用,来达到抗氧化损伤的目的[54]。另有报道采用荧光偏振技术和荧光法,观察人参、黄芪、四君子汤对小鼠红细胞膜流动性和血清过氧化脂质及肝组织脂褐素的影响。结果表明三者均能明显降低红细胞膜荧光偏振度,即显著提高红细胞膜的流动性,均可减少血清中过氧化脂质和肝脏中脂褐素含量,对脂褐素的影响复方优于单味。提示人参、黄芪、四君子汤均有显著的抗衰老、抗氧化作用[55]。使小鼠吸入臭氧(O3),在体内诱发较强的自由基反应,导致一系列类似衰老的变化,四君子汤能增强SOD活力,促进自由基消除,抑制和降低单胺氧化酶B(MAO-B)和血浆、脑、肝LPO的形成,提高机体耐力、抗寒力、耐缺氧能力[56]。内毒素血症或内毒素休克时血清和肝脏LPO浓度明显升高,SOD活性明显下降,且伴有肝窦内大量白细胞聚集。体外实验发现内毒素与白细胞一起与肝匀浆孵育,才可明显增加肝LPO生成量,与对照组相比有统计学意义,且与内毒素呈剂量依赖关系。说明内毒素白细胞并用引起肝LPO生成的增加可能是通过内毒素激活白细胞释放大量活性氧,使肝细胞膜发生脂质过氧化而实现的。四君子汤能降低内毒素白细胞并用对肝匀浆LPO的生成量,且下降值比对照组低,推测本方可通过酶性或非酶性清除活性氧的途径消除内毒素激活白细胞释放的活性氧,从而防止了肝细胞膜的受损[57]。临床研究也发现,用四君子汤治疗60例脾气虚型胃肠病患者,观察治疗前后血清总SOD、丙二醛(MDA)值,并与正常对照组比较。脾虚患者SOD低于对照组(P<0。01),而MDA偏高(P<0。01),治疗后与对照组无明显差异(P>0。05)。说明脾虚患者自由基清除能力下降,脂质过氧化反应增强,四君子汤能逆转此病理过程,提示本方一方面能改善脾气虚诱发自由基反应的各种因素,另一方面直接消除自由基或抑制其反应过程,从而阻止自由基反应对胃肠组织生物膜结构与功能的损伤[58]。张氏等[59]对60例用四君子汤治疗的脾气虚型消化疾病患者(简称脾气虚)进行了治疗前后血清SOD和丙二醛(MDA)的测定。60例住院的脾气虚患者,男27例,女33例,年龄17～71岁,平均38。5岁;病程10个月～30年,平均5。3年。其中以炎症为主者29例(慢性浅表性胃炎16例,慢性萎缩性胃炎3例,慢性十二指肠炎3例,慢性非感染性结肠炎7例),主要临床表现为:胃脘或少腹隐痛、大便溏薄、食欲减退、面色萎黄、舌胖有齿印、脉弱无力等;以溃疡为主者27例(慢性胃溃疡9例,慢性十指肠溃疡13例,结肠溃疡5例),主要临床表现为:胃脘隐痛,少腹坠胀,大便稀或兼潜血阳性,面色黄,乏力,舌淡苔白,脉弱无力等;以肿瘤为主者4例(胃癌、结肠癌各2例),主要临床表现为:胃脘或腹部疼痛且固定不移,食欲下降或进食困难,反胃或腑气不通,面色萎缩,肌瘦无力,少气懒言,自汗,舌淡,脉沉细弱。健康对照组50名,其中男22名,女28名,年龄18～45岁,平均39岁,均为同期体检的健康人。治疗方法:四君子汤由人参(红参)15～20g,白术、茯苓、炙甘草各20g组成。人参先煎40min,再与其他药物共煎30min,过滤,再共煎20min,共取400～500ml。每日晨空腹服,人参煎后取出嚼服。每日1剂,服药30d后评价疗效。检测方法:两组于晨分别采取空腹静脉血4。0ml。疗效标准:显效:患者所具有的上述症状、体征消失,舌象、脉象正常;有效:症状、体征、舌象、脉象好转;无效:症状、体征无改善。结果:显效27例,占45%;有效30例,占50%;无效3例,占5%。总有效率95%。SOD与MDA测定结果,见表12-3-30。脾气虚组治疗前血清总SOD显著低于对照组,P<0。01,而MDA则明显高于对照组,P<0。01;治疗前后比较均有显著性差异,P<0。01。12-3-30 四君子汤对脾气虚型消化道病患者血清SOD和MDA的影响(x±s)组别 例数SOD(Nu/ml)MDA(mmol/L)四君子汤组治疗前治疗后606055。2±27。5**99。7±28。8△△8。11±0。69**4。02±0。77△△对照组 50105。9±20。93。98±0。82注:与对照组比较:* * P<0。01;与本组治疗前比较:△△P<0。0114。2 抗自由基损伤的作用[60]将30只小鼠完全随机平分为3组:四君子汤合金匮肾气汤组(简称中药组):每只小鼠按每克体重灌胃给药0。02ml的中药煎剂,每日1次,预先给药10d,然后移入体积为6m×6m×2。8m的相对密封的室内进行紫外光辐射,辐射强度为40瓦特,距离1m,每日1次,每次40min,共10d。辐射期间继续给药;维生素E组、对照组:每只小鼠每克体重灌胃给药0。02 mg维生素E,其余处理同中药组;空白对照组(简称空白组):每只小鼠以0。5 ml的生理盐水灌胃,余同中药组。实验前后共20 d,至第21 d将所有小鼠断脊处死,迅速分离出肝、脑、肺组织,分别称重后加10倍量的生理盐水在冰浴下以10 000 r/min的速度进行组织捣碎3 min,然后将匀浆用20 000 r/min的速度作低温(-15℃)超速离心30 min,最后取上清液备测。3组小鼠肝、脑、肺组织中过氧化脂质含量(nmol/g蛋白质)比较。结果见表12-3-31。中药组和维生素E组小鼠肝、肺组织中的过氧化脂质含量分别明显低于空白对照组,P<0。05,但脑组织中的过氧化脂质含量与空白对照组无显著性差异,P>0。05。而中药组与维生素E组的小鼠肝、肺组织中的过氧化脂质含量无显著性差异,P>0。05,但脑组织中的过氧化脂质含量中药组则明显低于维生素E组,P<0。05[60]。表12-3-31 四君子汤合金匮肾气汤对小鼠肝、脑、肺组织中LPO含量的影响(nmol/g蛋白质,±s)组别n(只)肝脑肺中药组维生素E组对照组10101068±5*71±3*75±2174±6△182±9179±7174±3*174±5*182±6与对照组比较:* P<0。05;与VitE对照组比较:△P<0。05。3组小鼠肝、脑、肺组织中超氧化物歧化酶活力(nmol/g蛋白质)比较。结果见表12-3-32。中药组小鼠肝、脑、肺组织中的SOD活力均显著高于空白对照组(P<0。05),且肝、肺组织中的SOD活力还明显高于VitE组(P<0。05)[60]。表12-3-32 四君子汤合金匮肾气肠对小鼠肝、脑、肺组织中SOD含量的影响(nmol/g蛋白质,±s)组别n(只)肝脑肺中药组维生素E组对照组1010106312±519*△4492±6414610±3023375±1385*3346±13192239±8024560±647*△1942±5222168±154与对照组比较:* P<0。05;与维生素E对照组比较:△P<0。05实验结果表明:四君子汤合金匮肾气汤的煎剂能明显降低过氧化脂质在小鼠肝、肺组织中的堆积,具有较好的抗自由基损伤的作用。四君子汤合金匮肾气汤煎剂具有与维生素E相同强度的抗自由基损伤的作用,而在降低脑组织中过氧化脂质含量的作用方面则明显优于维生素E。在提高超氧化物歧化酶的作用方面,四君子汤合金匮肾气汤组小鼠肝、脑、肺组织中的超氧化物歧化酶的活力均显著高于对照组。说明四君子汤合金匮肾气汤的煎剂能提高小鼠这些组织中的超氧化物歧化酶的活力,中药对抗自由基损伤的机制可能主要是通过激发机体本身产生和提高超氧化物歧化酶的活力来进行的。而比较维生素E和对照组小鼠肝、脑、肺的组织中的超氧化物歧化酶的活力时可以发现,两者间并无显著性差异。14。3 对老龄鼠的脑、肝组织的影响[61]龚氏用透射电镜观察四君子汤(制成0。6 g/ml的药液)对衰老小鼠的肝和大脑皮质超微结构的影响。ICR小鼠,雌雄各半,60 d龄,随机分为3组:对照组、模型组、用药组。动物喂养20 d后,取肝脏和左侧大脑半球中央前回皮层组织进行观察。结果:肝脏:模型组(置于浓度为0。9ppm的O3环境中):肝细胞核圆形,大多较对照组肝细胞核小,核基质较致密,细胞质中几乎不见糖原颗粒,常见和糖原颗粒大小一致的无包膜均质小体区域性分布,线粒体体积普遍缩小,未见脂褐素颗粒,毛细胞管微绒毛不发达。给药组(本方12 g/kg·d-1,置于浓度为0。9ppm的O3环境中):肝细胞核椭圆形,明显大于模型组肝细胞核,常染色质多,核仁明显,有双层核膜包裹。细胞质中有大量糖原颗粒,未见无包膜物质小体,线粒体丰满,结构正常,粗面内质网发达,位于线粒体之间,细胞边缘有时可见高尔基体。毛细胞管微绒毛发达,与对照组肝细胞结构一致。说明四君子汤能明显改善衰老模型小鼠的肝细胞的超微结构。大脑皮质(中央前回皮质第Ⅲ、Ⅳ层脑细胞):模型组锥体细胞和颗粒细胞胞体及轴、树突结构与对照组无明显差别,仅突触后膜稍见增厚。毛细血管内皮结构尚完好,但基质增厚,最厚处有150～170μm,并且可见贴附于基膜上的神经胶质细胞的突起明显肿胀,呈空泡状改变,其中几乎没有结构。给药组锥体细胞和颗粒细胞胞须及轴、树突结构与对照组相似,毛细血管内皮结构完整,基膜已恢复至正常厚度,60～70μm,且贴附于基膜上的神经胶质细胞突起肿胀已逐渐消失。研究中还发现衰老模型组小鼠的大脑皮质的血-脑屏障出现了不同程度的结构改变,四君子汤能使衰老小鼠的大脑皮质中的毛细血管内皮结构、基膜及神经胶质细胞突起结构恢复正常。提示四君子汤对脑组织的老化具有一定防治作用。15。对去卵巢大鼠血清骨钙素(BGP)水平的影响[62]28只3月龄SD雌性大鼠随机分组:假手术组,去卵巢组和四君子汤药物组。实验90d,处死大鼠,心室取血,离心血清检测骨钙素。结果去卵巢组与假手术组比,BGP显著升高(P<0。01),四君子汤组与假手术组基本在同一水平,较去卵巢组低30%(P<0。01),表明四君子汤能抑制大鼠去卵巢90d血清骨钙素升高的变化。16。对免疫功能的影响16。1 对免疫器官的作用用限制食量导致营养不足的方法造成幼鼠胸腺萎缩,功能减退,胸腺组织中DNA和RNA含量显著下降。本方可促进DNA、RNA合成,促进细胞分裂,加速萎缩胸腺结构恢复正常并增强其功能[63]。从计量形态学指标观察,也发现本方对“气虚”小鼠的胸腺组织结构的恢复有明显促进作用,使“气虚”小鼠的胸腺皮质厚度、皮髓质厚度比、皮质细胞密度及皮质细胞核平均直径均有所增加。而对正常小鼠的胸腺结构无明显影响[64]。16。2 对脾细胞ADCC和NK活性的影响实验分为空白对照组每天0。4mlNS灌胃7d;CY组:NS用法同上,于第4d腹腔注射CY(100mg/kg);CY+四君子汤:CY用法同上,四君子汤0。4ml/d(20g/kg)灌胃7d;四君子汤组:剂量方法同上。用同位素(51Cr、125I-UdR)释放法检测四君子汤对小鼠脾细胞ADCC和NK活性的影响。125I-UdR和Na251CrO4的放射性浓度分别为268-334mCi/ml和10。6～13。6mCi/ml。16。2。1 四君子汤对小鼠脾细胞NK活性的影响[65]从表12-2-33结果可见:四君子汤组的NK活性高于空白对照组,但两组间无显著差异。当给小鼠腹腔注射CY后,其NK活性大幅度下降,当并用四君子汤后,NK活性显著升高,增强率达74。9%,但仍明显低于正常对照组,表明四君子汤能拮抗CY对小鼠脾细胞NK活性的抑制作用,但未能使其恢复至正常水平。表12-3-33 四君子汤对小鼠脾细胞NK活性的影响药物剂量鼠数NK细胞活性(±s,%)P值空白对照组 1517。61±2。29 四君子汤组环磷酰胺组四君子汤+CY组20g/kg100mg/kg20g/kg+100mg/kg14121719。17±3。276。22±1。0210。88±1。15**>0。05<0。001<0。02与CY组相比:* * P<0。0116。2。2 四君子汤对小鼠脾细胞ADCC活性的影响[65]如表12-3-34所示,四君子汤组小鼠ADCC活性较对照明显为高,而CY组的ADCC活性则明显低于对照组,当CY合用四君子汤时ADCC活性显著提高,增强率为74。79%,已接近NS对照组,表明四君子汤不但能增强正常小鼠脾细胞的ADCC活性,还能使CY所致的小鼠脾细胞ADCC活性的降低恢复至接近正常水平。表12-3-34 四君子汤对小鼠脾细胞ADCC活性的影响药物剂量鼠数ADCC活性±s,%P值空白对照组 1616。38±1。72 四君子汤组环磷酰胺组四君子汤+CY组20g/kg100mg/kg20g/kg+100mg/kg17161622。54±1。529。36±0。8716。36±2。25**<0。02<0。001>0。05与CY组相比:* *P<0。01采用同位素释放检测了四君子汤对小鼠脾细胞的细胞毒功能的影响,结果表明,其对正常小鼠脾细胞ADCC和NK活性影响不全相同:对NK活性无明显影响,但对ADCC活性却能显著提高之。这种差异的原因可能有两点:一是四君子汤对抗体形成细胞有刺激作用,可使B细胞分化成更多的浆细胞,从而使抗体增加;二是四君子汤可能通过某种途径促进脾脏淋巴细胞(主要是K细胞)表面的Fc-R增加,以致能结合更多的抗体,而加强对靶细胞的杀伤作用,使该项指标更为敏感。实验1次给小鼠大剂量注射CY后,ADCC和NK活性均显著降低,可用这种状况比拟中医理论中的“邪之所凑,其气必虚”。四君子汤能拮抗CY对小鼠脾细胞ADCC和NK活性的抑制作用,在CY造成的免疫抑制状态下,对这两种细胞毒活性具有同样的增强效应。脾细胞的ADCC和NK活性在一定程度上反映了机体的免疫监视功能,与控制恶变细胞的增殖密切有关。肿瘤患者于中晚期大多呈虚证表现,其细胞免疫功能降低较明显,加上再应用化疗药物,更使免疫功能受抑,因而降低了对肿瘤生长的监视与控制作用。四君子汤不仅能提高正常小鼠脾细胞的ADCC活性,提示在肿瘤病人进行手术、放、化疗的同时,四君子汤可作为“扶正祛邪”的主要辅助治疗剂,以调整肿瘤患者的免疫功能,利于机体主动杀伤手术后残余的瘤细胞,从而达到“祛邪不伤正”之效。16。3 对中性粒细胞功能的影响近年的研究表明,中性粒细胞不仅是炎症过程中的重要细胞成分,而且能调节T细胞、B细胞、单核-巨噬细胞等多种免疫活性细胞功能,从而发挥重要的免疫调节作用。中性粒细胞本身在免疫和炎症过程中也起重要作用[66]。观察四君子汤及其组成中药在体外对人外周血中性粒细胞的功能的影响,发现四君子汤水提液在体外不同程度地抑制人外周血中性粒细胞的粘附,减低化学发光的强度,减少超氧阴离子的产生和血栓素B2的产生,中性粒细胞粘附于内皮细胞是中性粒细胞进入组织执行其功能的第一步,也是中性粒细胞活化的关键,中性粒细胞的粘附与其表面的粘附分子有关。四君子汤可能是通过改变中性粒细胞表面粘附分子的数量、亲和力或分布从而改变其粘附能力。这一作用可能使其成为治疗缺血后损伤和慢性炎症(都与中性粒细胞浸润有关)的新药。中性粒细胞的化学发光反映中性粒细胞内氧化过程和活性氧的产生。四君子汤对小量产生的活性氧的抑制作用或许与其抗衰老作用有关。血栓素A2(TXA2)在中性粒细胞活化时产生,TXA2有强烈的促进血小板聚集、血管收缩,促进凝血及血栓形成的作用,故与血瘀有关。四君子汤明显抑制TXA2的合成,可能是益气活血治则的药理基础之一[67]。16。4 对腹腔巨噬细胞功能的影响[68]空白对照组,每天每只小鼠0。4ml生理盐水连续灌胃7d;环磷酰胺(CY)组,生理盐水用法同上,且第4d腹腔1次性注射CY(100mg/kg);四君子汤组,四君子汤每只0。4ml/d(相当于生药1g/ml),连续灌胃7d; CY加四君子汤组,CY和四君子汤用法同上。采用51Cr、125 Ⅰ-UdR释放方法检测四君子汤对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞介导的肿瘤细胞溶解作用(WTC)和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的影响,见表12-3-35。表12-3-35 四君子汤对MTC、ADCC活性的影响组别动物数(只)MTC活性增强率(%)动物数(只)ADCC活性增强率(%)(%,±s)(%,±s)NS组1512。86±1。27-1222。11±3。44-CY组四君子汤组四君子汤加CY组1417145。82±0。9316。83±1。8910。15±1。53-54。7412。8674。40*1214127。56±1。3227。53±2。8816。71±2。29-65。8122。51121。03**注:与CY组比较:* P<0。05,* * P<0。01四君子汤组活性虽然高于空白对照组,但两者无明显差异,P>0。05。而CY组的活性明显低于空白对照组,P<0。01;当加用四君子汤后,活性显著升高,与单用CY组相比,差异有显著意义,P<0。05,增强率为74。40%。结果表明,四君子汤能拮抗CY对小鼠腹腔巨噬细胞介导的MTC活性的抑制作用,而对免疫功能正常的小鼠影响不大。四君子汤组的ADCC活性最高,但与生理盐水组相比差异无显著性意义。而CY组ADCC活性最低,与空白对照组相比差异有非常显著性意义,P<0。01;加用四君子汤后与CY组相比,ADCC活性升高非常显著,P<0。01,已趋于正常,而增强率已达121。03%。从本实验结果来看,四君子汤对小鼠腹腔巨噬细胞介导的MTC和ADCC活性的影响有类似效应,所不同的是在免疫抑制状态下ADCC的敏感性要高于MTC。16。5 对CY抑制的小鼠骨髓细胞计数的影响[69]给药第8d处死小鼠,分离右后肢股骨,剪去两端骨骺,用1ml 2%冰醋酸灌洗骨髓腔,将冲出的骨髓细胞稀释后计数,测得每根股骨所含细胞数×106。结果,空白对照组为3。4±0。7(n=7),CY组为19±0。7(n=6),和空白对照组比较P<0。05,CY+四君子汤CY+四君子汤以及CY+八珍汤,骨髓细胞数分别为3。5±2。1,2。5±1。1以及3。3±1。8(n均为6),和CY组比较P>0。05,但都有提高趋势。其中,四君子汤作用较好,四物汤作用最差。16。6 对CY抑制的小鼠碳粒廓清速率的影响[69]给药第5日每鼠尾静脉注射印度墨汁(用生理盐水稀释5倍)10ml/kg,注射后20min采血检测,计算廓清指数K。结果见表12-3-36。表12-3-36 四君子汤对CY抑制的碳粒廓清速率的影响(x±s)组别剂量动物数(只)廊清指数K空白对照组 90。036±0。014CY组CY+四君子汤组10mg/kg×5d10g/g×5d9120。024±0。008*0。036±0。009△△注:与生理盐水组比较:* P<0。05;和CY组比较:△P<0。05,△△P<0。01上表结果表明,CY能抑制小鼠碳粒廓清速率。四君子汤能对抗CY抑制的碳粒廓清速率,和CY组比较,四君子汤组P<0。01。16。7 对CY抑制的绵羊红细胞(SRBC)致敏小鼠溶血素生成的影响[69]CY剂量为10mg/kg,腹腔注射,每日1次。于给药当日用10%SRBC0。2ml腹腔注射免疫小鼠,免疫后第5日眼球采血,分离血清检测,计算半数溶血值(HC50)。结果见表12-3-37。表12-3-37 四君子汤对Cy抑制的SRBC致敏小鼠溶血素生成的影响(±s)组别剂量动物数HC50空白对照组 9120。56±35。36CY组CY+四君子汤组10mg/kg×5d10g/kg×5d7926。73±23。64**63。08±32。39△注:与生理盐水组比较:* *P<0。01;和CY组比较:△P<0。05。上表结果显示,CY显著抑制溶血素生成。四君子汤能对抗Cy抑制溶血素生成的作用,P<0。05。16。8 对环磷酰胺(CY)抑制的2,4-二硝基氯苯(DNCB)所致小鼠迟发型皮肤超敏反应(DCH)的影响[69]。取ICR小鼠分组,空白对照组每日按20ml/kg灌胃,连续10d,隔日以等容积生理盐水腹腔注射,CY组每日用生理盐水按20ml/kg灌胃,连续10d,隔日腹腔注射CY30mg/kg;四君子汤组按10g/kg的剂量灌胃,每日1次,连续10d,隔日分别腹腔注射CY30mg/kg,先用50%DNCB丙酮溶液在颈部致敏,10d后尾静脉注射1%伊文思蓝溶液10 ml/kg,30 min后处死小鼠,取腹部蓝染皮肤,剪碎,用丙酮生理盐水溶液浸泡24 h,离心,取上清液测OD值(λ=610nm),结果见表12-3-38。表12-3-38 四君子汤对Cy抑制的DNCB所致小鼠DCH反应的影响(±s)组别剂量动物数(只)皮肤反应OD空白对照组 120。598±0。689CY组CY+四君子汤组30mg/kg×10d10g/kg×10d12120。352±0。082*0。670±0。457△注:与生理盐水组比较:* P<0。05;与CY组比较:△P<0。05上表结果表明,CY能抑制DNCB所致小鼠DCH反应。四君子汤能对抗CY抑制的DCH反应,P<0。05。16。9 对氢化可的松(HC)抑制的淋巴细胞增殖试验的影响[69]将C57 BL/6J小鼠6只断头放血处死,在65%酒精中浸泡后,无菌条件下取出脾脏,制备脾细胞悬液,将红细胞溶解后用含10%小牛血清的PRMI 1640培养液将脾细胞稀释为4×107/ml。向24孔培养板中分别加入脾细胞悬液100μl,50μg/ml ConA 100μl(终浓度5μg/ml),20mg/ml的四君子汤100μl(终浓度2mg/ml)。再分别加入2μg/ml HCl 100μl(终浓度2 mg/ml),每孔分别用RPMI 1640培养液补充至1 ml,同时设立不加HC和药物的正常对照组及不加药物的HC对照组。将培养板放入含有5%CO2的湿度饱和培养箱中,37℃培养44 h,从每孔中吸出上清液0。5 ml弃去,以减少小牛血清的含量,再加入0。4 mg/ml MTT0。5 ml(终浓度0。2mg/ml),继续培养4h,用752型分光光度计测OD值(λ=570 nm),结果见表12-3-39。表12-3-39 四君子汤对HC抑制的淋巴细胞增殖的影响(±s)组别动物数(只)OD对照组HC组HC+四君子汤组6660。419±0。0290。326±0。037*0。788±0。148**注:HC终浓度为0。2μg/ml;四君子汤终浓度为2 mg/ml;与对照组比较:* P<0。05;与HC组比较:* * P<0。0116。10 对脾虚患者血清可溶性细胞粘附分子-1水平及单核细胞功能的影响[70]细胞粘附分子(CAM)是位于多种细胞表面的一类大分子糖蛋白,它通过介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的粘附作用参与一系列生理、病理过程,发挥重要作用。在一些因素作用下,细胞粘附分子可以从细胞表面脱落进入血液循环,形成可溶性细胞粘附子分子(sICAM)。脾虚时可使多种细胞粘附分子表达发生变化,表现为免疫功能的低下。单核细胞和巨噬细胞能分泌白细胞介素15(IL-15),IL-15的分泌水平及其抗体依赖的单核细胞或巨噬细胞抗体依赖性介导的细胞毒反应(ADCC)是机体非特异性的免疫功能。章梅等观察66例脾虚患者血清可溶性细胞粘附分子-1(sICAM-1)的变化和单核细胞或巨噬细胞的功能状况及四君子汤对其影响。66例为中医科门诊与住院患者,均符合脾虚证辨证参考标准。即乏力,食后或午后腹胀,便溏,消瘦,面色不华,舌淡苔白,脉虚无力,具备3项以上。病程在0。5年以上。将66例脾虚患者随机分为两组,四君子汤治疗组和六味地黄汤治疗组。四君子汤治疗组33例,男16例,女17例,年龄32～59岁,平均为47。96±8。42岁。六味地黄汤治疗组33例,男18例,女15例,年龄31～61岁,平均为46。82±8。15岁。两组资料具有可比性。正常对照组15名,男8名,女7名,均来自血库健康献血者。给药方法:受试者停服中西药物1周,采用双盲法给药,经配对的患者按随机数字表达法分为四君子汤治疗组和六味地黄汤治疗组,由专人发药,服药剂量为200ml/次,浓度60g/L,每日2次,早晚空腹服用,疗程5～6周,于给药前后复查指标。结果见表12-3-40。表12-3-40 四君子汤对脾虚患者sICAM-1、IL-15分泌和单核细胞ADCC的影响(x±s)组别例数sICAM-1(μg/L)IL-15(u/L)LPS刺激后IL-15(u/L)ADCC(×104,个)正常对照组脾虚(治疗前)组四君子汤治疗组六味地黄汤治疗组156633331。31±0。174。65±0。68**△△1。27±0。144。57±0。53**△△6。95±4。273。21±2。48**△△6。72±3。173。14±3。23**△△8。60±4。224。59±3。18**△△9。08±4。144。12±3。54**△△1。0046±0。39160。5504±0。2152**△△1。0031±0。28740。5712±0。3082**△△注:与正常对照组比较:* * P<0。01;与四君子汤治疗组比较,△△P<0。01脾虚患者较正常对照组sICAM-1显著升高,IL-15、LPS刺激后IL-15分泌显著减少和ADCC明显低下,而四君子汤治疗后各指标与正常对照组无明显差异;六味地黄汤治疗组各指标则与治疗前无明显差异。16。11 对脾虚肾脏病患者血清尿蛋白含量和细胞因子的影响[71,72]肾脏疾患可见血清和尿中有关蛋白质含量和细胞分子的变化,血清中β2微球蛋白(β2-MG)在TH精蛋白(THP),尿中β2-MG、THP、白蛋白(ALBUMIN)、TNF、IL-6、IL-8等作为衡量肾脏疾患病情程度与诊断等方面十分有价值的参考指标。章梅等观察了四君子汤对脾虚型肾脏病人血清及尿中有关蛋白质含量和细胞因子的变化。肾脏疾患组57人,其中男32人,女25人;慢性肾炎34人,肾病综合征10人,尿毒症1人,慢性肾盂肾炎6人,肾囊肿2人,紫癜肾4人,均符合脾虚证辨证参考标准。将其分为2组:脾虚组和六味地黄汤治疗组。脾虚组29人,男17人,女12人,年龄18～56岁;六味地黄汤治疗组28人,男14人,女14人,年龄17～56岁。正常对照组16人,男11人,女5人,年龄29～56岁,为健康查体者。给药方法:受试者停服中西药物1周,采用双盲法给药,经配对的患者按随机数字表达法分为脾虚组和六味地黄汤治疗组。服药剂量为200ml/次,浓度均为60g/L,每日2次,早晚空腹服用;疗程5～6周,于给药前后复查指标。结果见表12-3-41,表12-3-42,表12-3-43。表12-3-41 四君子汤对各组血β2-MG及THP含量的影响(±s)组别例数β2-MG(μg/ml)THP(μmg/ml)正常组脾虚组脾虚组疗后六味治疗组162929282。42±0。804。78±0。96*△3。84±0。72*4。61±0。82*△2。70±90101。8±70。09**△210。3±65。42*115。7±74。62**△注:与正常组相比:*P<0。05,**P<0。01;与脾虚组四君子汤治疗后相比:△P<0。05表12-3-42 四君子汤对各组尿中有关蛋白质含量的影响(±s)组别例数β2MG(μg/ml)THP(μmg/ml)ALBUMIN(mg/24h)正常组脾虚组脾虚组治疗后六味治疗组16292918160±12。6467。9±231**△△251。6±124*456。8±21。6**△△34±19。215。73±23。29**△△25。32±21。6*7。18±22。7**△△12±6。7065。59±33。04**△△38。82±21。08*64。14±19。53**△△注:与正常组相比:*P<0。05,**P<0。01;与脾虚组四君子汤治疗后相比:△P<0。05表12-3-43 四君子汤对各组尿中细胞因子含量的影响(±s)组别例数IL-6(ng/L)IL-8(ng/L)TNF(ng/L)正常组脾虚组脾虚组治疗后六味治疗组1629292828±19285±92**△△103±96*274±151**△△20±12341±127**△△151±132**313±144**△△37±20256±114**△△119±98**249±76**△△注:与正常组相比:*P<0。05,**P<0。01;与脾虚组四君子汤治疗后相比:△P<0。05研究发现脾虚型肾脏疾病患者血中β2-MG较正常人显著增高(P<0。05),血中THP含量则显著低于正常人。同时尿中的β2-MG和ALBUMIN均比正常组高,但THP却低于正常人。从研究结果分析,血及尿中有关蛋白质和细胞因子含量的变化,可能是肾脏功能变化的一个微观上的具体表现。经过四君子汤治疗后,脾虚型肾脏疾病患者血清和尿中β2-MG,THP、ALBUMIN及IL-6、IL-8、TNF均有所恢复,但数值仍未和正常人一致(P<0。05)。以上结果显示四君子汤健脾可以改善血清及尿中有关蛋白质和细胞因子含量的变化,使患者趋向于恢复正常的方向发展;但仍与正常人有一定的差距,推测与服药时间短,未能全面改善肾脏功能有关。16。12 对脾虚动物淋巴细胞分泌集落刺激因子的促进作用[73]将36只BALB/C小鼠随机分为3组,每组12只。正常组:每日皮下注射生理盐水0。2 ml/只,同时每日灌服蒸馏水0。25 ml/只;脾虚组:每日皮下注射利血平0。3mg/kg,并灌服蒸馏水0。25 ml/只;四君子汤治疗组:每日皮下注射利血平0。3mg/kg,并每日灌服四君子汤煎液0。25 ml/只(含生药1 g)。于第6d始,脾虚组小鼠出现稀便,食量减少,少动,毛色无光等症状。于第12d,脾虚小鼠稀便、少动、体重减轻等脾虚诸症加重,而治疗组和正常组均无此表现。脾(胸腺)细胞悬液制备:杀鼠后,无菌取脾(胸腺),用小钢网磨碎,制成单细胞悬液,用60%Percoll淋巴细胞分离液离心分出淋巴细胞,离心洗涤细胞3次,调细胞浓度5×107/ml。含集落刺激因子培养液的制备:24孔板培养脾(胸腺)细胞,每孔含培养物1ml,内含5×106细胞,20%新生牛血清、5μgConA及RPMI-1640液,在37℃、5%CO2条件下培养48h,收集离心上清液,冻存备用。集落刺激因子活性测定:同一品系小鼠数只,杀死后取双侧股骨,冲骨髓内细胞,制成单细胞悬液,在含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液内,在37℃、5%CO2条件下贴壁培养2h,收集未贴壁的骨髓细胞计数,调细胞浓度为5×106/ml。无菌96孔板,每孔含培养物20μl,内含5×106/ml骨髓细胞、20%新生牛血清、10%集落刺激因子、待测液及RPMI-1640液,在37℃、5%CO2条件下培养4d在终止培养前6h,每孔加H3-TdR100μl(浓度3。7×10-4GBq)收集细胞,用液闪仪测放射性计数CPM值。刺激指数(SI)=ConA刺激实验组-机器本底/阴性对照组-机器本底。四君子汤对淋巴细胞分泌集落刺激因子作用的体外实验:按上法常规制备脾虚鼠脾(胸腺)淋巴细胞悬液,计数活细胞数>95%,调细胞浓度为2×106/ml取100μl完全培养液中的淋巴细胞悬液(内含ConA,终浓度5μg/ml,同时设不加ConA对照孔),加入96孔培养板各孔中,并分别于各孔中加入四君子汤煎液(经煎煮后离心3000r/min,20min过滤除菌),终浓度分别为25mg/ml,50mg/ml,100mg/ml,200mg/ml,并设不加药液加ConA阳性对照组,设加入药液不加ConA的非特异性对照组。于48h后,对各浓度培养孔淋巴细胞进行活力检测,计数活细胞>95%,表明药物无细胞毒性,于各孔加入浓度为10μl/mlH3-TdR50μl,再培养6h后收集细胞,用液闪仪测放射性计数CPM值。增殖水平直接用CPM值表示,或用SI表示。SI=四君子汤刺激实验组-机器本底/阴性对照组-机器本底。四君子汤组脾及胸腺T淋巴细胞生成集落刺激情况比较:表12-3-44示,脾虚组脾和胸腺T淋巴细胞生成集落刺激因子的功能较正常组明显低下(P<0。01),四君子汤治疗组与正常组相比,差异无显著性。四君子汤体外对脾虚鼠脾及胸腺淋巴细胞分泌集落刺激因子的影响:表12-3-45,表12-3-46示,四君子汤液各浓度对脾虚鼠脾及胸腺T淋巴细胞合成集落刺激因子均有明显增强作用,随着浓度的增加,其作用强度加大,100mg/ml和200mg/ml两浓度的作用强度相比差异无显著性(P>0。05)。表12-3-44 3组鼠脾及胸腺T淋巴细胞生成集落刺激因子情况比较(x±s)分组例数脾T淋巴细胞胸腺T淋巴细胞CPMSICPMSI正常组脾虚组治疗组1212127809。63±2069。343550。6±157。728843。69±3376。633。71±1。402。15±0。80**△△4。64±1。504236±6842517±568**△△4411±8323。91±1。242。07±0。98**△△4。25±1。97与治疗组比较:* * P<0。01;与正常组比较:△△P<0。01表12-3-45 不同浓度四君子汤体外对脾虚鼠脾T淋巴细胞分泌集落刺激因子的影响(x±s)四君子汤终浓度(mg/ml)例数实验组(ConA+四君子汤)对照组(四君子汤)空白对照组083824±169△△ 1621±654255010020088884267±504**7823±1080**10237±1149**10386±1252**2367±481△1921±6232057±5772104±721 实验组与对照组比较:* * P<0。01;与空白对照组比较:△P<0。05,△△P<0。01表12-3-46 不同浓度四君子汤体外对脾虚鼠胸腺T淋巴细胞分泌集落刺激因子的影响(±s)四君子汤终浓度(mg/ml)例数实验组(ConA+四君子汤)对照组(四君子汤)空白对照组082532±243△△ 1154±387255010020088883871±422**5089±521**8263±1025**8432±1103**1284±3741436±4121722±465△1845±680△ 实验组与对照组比较:* * P<0。01;与空白对照组比较:△P<0。05,△△P<0。01实验研究证明,脾虚时脾和胸腺T细胞分泌集落刺激因子下降,与正常组和四君子汤治疗组相比有显著差异(P<0。01)。但四君子汤治疗组和正常组则无差异,说明四君子汤在体内对造血功能和免疫功能有广泛的调节作用。在体外试验中,四君子汤各浓度组(25mg/ml,50mg/ml,100mg/ml,200mg/ml)对脾虚鼠脾和胸腺T淋巴细胞合成集落刺激因子均有明显的增强作用,随着浓度的增加,其作用强度越大,当浓度为200mg/ml时,作用强度最大,但100 mg/ml和200 mg/ml两浓度的作用强度相比无明显差异。阳性对照组与各浓度非特异性刺激对照组比较均无显著差异,表明四君子汤液无丝裂原作用,但可与ConA共同起促增值作用。16。13 对中医辨证肾虚、脾虚等患者的免疫调节作用许氏等[74]用现代免疫学多项指标,以肾虚、脾虚、血瘀证患者为研究对象,对补肾、健脾、活血类中药复方(即右归饮、四君子汤、桃红四物汤)3类中药复方辨证用药的作用进行横向比较研究,以提示3类中药免疫调节效应的异同,并为进一步研究3类中药复方调节免疫的机制提供依据。对象选择标准:年龄40～70岁,符合中医肾虚、脾虚、血瘀证诊断标准。排除自身免疫性疾病、内分泌疾病、严重的心、肺、血液及肝肾疾病患者。3个证型组各60例,每证型组按2:1比例随机分成治疗组40例和对照组20例,另从健康职工中选择无肾虚、脾虚、血瘀证表现的志愿者作免疫指标对照,共计23例,其中男12例,女11例;年龄36～60岁,平均53。4±6。2岁。方药组成:右归饮:熟地9 g,山茱萸3 g,山药6 g,枸杞子6 g,杜仲6 g,肉桂6 g,附子6g,甘草6 g。四君子汤:人参10g,白术10 g,茯苓10g,炙甘草6g。桃红四物汤:当归9g,赤芍9g,生地12g,川芎6g,红花6g,桃仁6g。上述3方均加工成浸膏片(每15片含原方规定生药剂量的50%)。治疗方法:肾虚证、脾虚证、血瘀证型组中的治疗组分别服用右归饮、四君子汤、桃红四物汤,每次5片,3次/d,疗程为3个月。3个证型组中的对照组均服用外观包装与治疗药物相一致的糖衣片,由淀粉和赋形剂组成,服法同治疗组。临床症候改善评判标准:显效:症候积分值降低大于1/2;有效:临床症候积分值降低1/3～1/2;无效:临床症候积分值降低小于1/3。临床疗效:见表12-3-47。右归饮、四君子汤、桃红四物汤对各自的症候均有显著的改善作用,总有效率分别与各自证型对照组比较有显著性差异(P<0。05)。不同证型患者免疫功能的测定结果,见表12-3-48。与健康人组比较,治疗前3个证型组患者的循环免疫复合物(CIC)水平较高,淋转率和NK细胞活性降低;肾虚组的γ-IFN水平降低。脾虚组的γ-IFN和嗜中性粒细胞吞噬指数降低。治疗前3个证型中治疗组和对照组的免疫功能指标均无明显差异;治疗后肾虚型的治疗组CIC水平较治疗前明显下降(P<0。01),淋转率和NK细胞活性明显升高(P<0。01),同时比同证型的对照组水平有所提高(P<0。05)。脾虚型的治疗组CIC水平较治疗前和同证型对照组均明显下降(P<0。01),淋转率和NK细胞活性较治疗前明显提高(P<0。01),也比同证型对照组水平提高(P<0。01和P<0。05);IL-2水平和嗜中性粒细胞吞噬指数较治疗前提高(P<0。05),也比同证型对照组提高(P<0。05)。血瘀证型治疗组治疗后CIC水平较治疗前及同证型对照组明显下降(P<0。01),NK细胞活性较治疗前和同证型对照组提高(P<0。05)。表2-3-47 3证型组患者一般情况 组别例数男女年龄(岁,±s)病种(例)(例)慢性支气管炎慢性胃肠炎心血管病其他无明确诊断疾病肾虚治疗对照40202310171058。1±7。157。2±6。8137433273135脾虚治疗对照4020201120956。3±7。055。6±7。2751363164114血瘀治疗对照4020191121956。8±7。555。0±7。274429583126表12-3-48 右归饮、四君子汤等中医证型的临床疗效(例,%) 组别例数显效有效无效总有效肾虚右归饮组对照组402018(45。0)*017(42。5)2(10。0)5(12。5)18(90。0)35(87。5)*2(10。0)脾虚四君子汤组对照组402016(40。0)*020(50。0)1(5。0)4(10。0)19(95。0)36(90。0)*1(5。0)血瘀桃红四物汤组对照组402016(40。0)*018(45。0)2(10。0)6(15。0)18(90。0)34(85。0)*2(10。0)注:与本证型对照组比较:* P<0。05表12-3-49 3个证型组患者治疗前后免疫指标测定结果比较(x±s)组别例数 G3补体(g/L)CIC(OD值)淋转率(cpm)IL-2(u/L)γ-IFN(ng/L)噬中性粒细胞吞噬指数NK细胞活性(%)肾虚治疗40治疗前治疗后1。66±0。591。62±01430。21±0。09*0。14±0。05△△26492±17848*52933±38142△△▲8。42±5。649。70±5。97790±691*969±7300。28±0。120。30±0。1327。80±9。18**41。20±13。20△△▲对照20治疗前治疗后1。67±0。431。59±0。410。21±0。100。19±0。1126437±1062830051±234818。55±2。868。30±6。10777±770999±9190。28±0。100。28±0。1132。25±12。0029。47±17。20脾虚治疗40治疗前治疗后1。64±0。401。58±0。670。21±0。07*0。13±0。04△△▲▲25925±14394**55688±33819△△▲▲7。78±6。4211。61±4。72△▲605±591**888±6850。24±0。08*0。32±0。15△▲24。00±12。02**39。20±14。00△△▲对照20治疗前治疗后1。60±0。351。58±0。500。21±0。060。22±0。0722866±2077627771±104337。79±2。267。77±6。80570±409498±3470。26±0。060。25±0。1226。70±9。7027。80±11。80血瘀治疗40治疗前治疗后1。73±0。351。66±0。510。22±0。03**0。14±0。05△△▲▲34842±27849*40659±345218。83±5。508。79±6。391020±773889±6950。29±0。120。30±0。1328。60±11。70*39。40±13。50△对照20治疗前治疗后1。75±0。401162±0。430。22±0。030。20±0。0733031±2461936379±2674710。94±6。7010。84±6。081166±836920±8540。30±0。070。30±0。0730。50±9。3034。25±5。71健康人23 1。80±0。360。15±0。0350145±2203310。31±2。051392±5310。29±0。0339。33±7。90注:与健康人组比较:* P<0。05,* * P<0。01;与本组治疗前比较,△P<0。05,△△P<0。01;与同证型对照组治疗后比较,▲P<0。05,▲▲P<0。0116。14 对环磷酰胺外周血细胞和CD25(IL-2R)的影响50只SD大鼠,雌雄兼半,体重210～230 g,除正常组(10只)除外,其余40只大鼠均用CY一次腹腔内注射造模,剂量为200mg/kg体重。随机分为5组,灌胃生理盐水或中药9 d,每日2次。正常组:生理盐水灌胃,每次1。5 ml。模型组:造模前5 d和后4 d灌胃生理盐水,每次1。5 ml。葆春丸组:灌胃葆春丸(由何首乌、巴戟天、细辛、生地、桂枝等组成),用药时间与用量同模型组。四君子汤组:灌胃四君子汤(人参、白术、茯苓、甘草),用药时间与用量同模型组。复合组:灌胃葆春丸和四君子汤,每次3 ml。以上用药组用量相当于临床成人用药量的20倍(g/kg体重)。各组于注射CY后第4d取血受试。健脾和补肾方药对一般情况的影响:模型组泄泻,成群蜷卧,毛色不泽,散乱竖起为10只,脱发8只,脱肛6只。四君子汤组泄泻5只、脱肛2只,成群蜷卧,毛色不泽,散乱竖起为4只。复合组泄泻、成群蜷卧、毛色不泽、散乱竖起、脱毛均为3只,脱肛2只。正常组和葆春丸组均无上述表现。健脾和补肾方药对WBC、RBC和CD25百分率的影响:见表12-3-50。模型组WBC和CD25水平低于正常组(P<0。01),葆春丸组、四君子汤组及其复合组的WBC和CD25水平均显著高于模型组(P<0。01)。在升高CD25水平方面,葆春丸组和复合组明显高于四君子汤组(P<0。05～0。01),而前二组间比较无差异(P<0。05);在提高WBC计数上葆春丸组优于复合组(P<0。01),后者高于四君子汤组(P<0。05)。各组间RBC水平均无明显差异。表12-3-50 四君子汤等各组间WBC和RBC计数及CO25百分率的比较(±s)组别动物数(只)WBC(×106/L)RBC(×109/L)CD25(%)正常组模型组葆春丸组四君子汤组复合组101010101011。948±2。0632。843±1。131△△12。700±3。449**5。867±2。442△△**★★8。229±2。54△▲★★**8。242±1。4247。490±0。6729。929±2。2918。074±1。1399。384±3。48912。678±4。862**6。971±2。690△△13。166±5。269**9。300±2。021△★★**11。983±4。208▲**与正常组比较:△P<0。05,△△P<0。01;与模型组比较:** P<0。01;与葆春丸组比较:★★P<0。01;与四君子汤组比较:▲P<0。05本实验结果表明,CY导致大鼠泄泻、脱肛、成群蜷卧、毛色不泽、散乱竖起、脱毛等,四君子汤和葆春丸及二者合用方药对上述症状均有明显改善作用,其中以葆春丸的作用为优,该组无一只大鼠出现上述任何表现。已知血液中粒细胞的平均寿命为0。375 d,周围血象的变化能直接反映造血器官的功能状态,而且周围血象变化的速度和深度,与化疗药物损坏的程度有着密切关系。结果表明,CY导致大鼠外周血WBC数明显降低,葆春丸和四君子汤及其复合方药均能使WBC水平升高,其中葆春丸优于复合方药,后者又优于四君子汤。提示健脾和补肾方药均能保护骨髓造血功能以提高外周WBC数目,其中以补肾方药和健脾补肾方药的作用明显,单纯益气健脾的四君子汤之作用不及前两组方药。实验中大鼠在接受CY处理后RBC未明显减少,各组方药对RBC均无明显影响,这可能是由于红细胞在周围血中的寿命较长(120 d),骨髓抑制对红细胞的影响短时间内不易从外周血象反映出来的缘故。葆春丸和四君子汤及其复合制剂均能提高CD25水平,即增加IL-2R水平,其中以葆春丸为代表的补肾方药及其合四君子汤为代表的健脾补肾方药升高IL-2R水平明显,这可能是补肾和健脾补肾方药治疗肿瘤及减降化疗药物毒副作用的主要机制之一。有报道,四君子汤(1:2水煎醇沉液10 ml/kg qd×7 d灌服)具有明显降低环磷酰胺(100 mg/kg腹腔注射)造成的造血功能的抑制,红、白细胞数分别降至4。95±1。03(百万个/mm3)和3。15±0。09(千个/mm3),而加用四君子汤组则分别为6。29±1。7(百万个/mm3)和7。10±1。13(千个/mm3)。并可显著控制环磷酰胺造成的胸腺、脾脏、肾上腺、睾丸的萎缩,染色体畸变等毒副作用[76]。研究发现,本方能显著促进小鼠脾淋巴细胞自发性的ConA刺激的3H-TdR掺入。3H-TdR掺入的多少是淋巴细胞活化的指征之一。淋巴细胞活化时,DNA合成增多,3H-TdR掺入增加,提示四君子汤能通过促进DNA合成,促使淋巴细胞活化。活化的淋巴细胞能分泌包括CSFs在内的多种淋巴因子,参与机体细胞免疫、体液免疫和骨髓造血功能的调节。观察结果表明本方能促进淋巴细胞活化,进而促进其分泌CSFs。四君子汤组小鼠制备的脾条件培养液(SCM),在低稀释度(1:1～1:4)时,CSFs水平显著低于对照组(P<0。005);相反,在高稀释度(1:8～1:32)时,CSFs水平则显著高于对照组(P<0。025)。提示前者含有抑制CSFs活性的物质(或因子),该物质的抑制作用随SCM稀释度的增大而逐渐减弱,以至消失;后者含有高水平的刺激骨细胞增殖的CSFs。两种物质(或因子)兼容,可能与该方剂中四味中药的配伍有关,四君子汤促进CSFs分泌,可能与补气药人参、白术的药理作用有关,低稀释度SCM中存在抑制CSFs活性的物质与甘草的药理作用有关[52]。用大黄造成小鼠脾虚模型,以红细胞膜C3b受体花环和免疫复合物花环试验反映红细胞免疫功能,结果发现,脾虚小鼠红细胞C3b受体花环率显著降低,免疫复合物花环率明显升高,四君子汤可使前者明显升高,后者明显下降,提示该方有调节红细胞免疫功能的作用[77]。给小鼠每日灌服100%四君子汤煎剂(15ml/kg)连续6d,能纠正免疫抑制剂地塞米松或环磷酰胺的免疫抑制作用,表现在免疫抑制小鼠的巨噬细胞吞噬率、淋巴细胞转化率、外周血ANAE+淋巴细胞比率以及血清特异性抗体水平均有明显恢复[78]。用60Co照射(600拉德)作为损伤大鼠非特异性免疫因素,观察四君子汤对免疫功能的影响,结果表明,给药组四君子汤煎剂(100%,3ml/只,qd×10,po)的迟发超敏反应准确度较对照组明显提高,血清总补体活性和血清溶菌酶含量也较对照组显著升高[79]。党参方的四君子汤能明显提高小鼠腹腔Mφ吞噬功能,使吞噬率及吞噬指数均明显增加。拆方实验发现,党参、白术、茯苓均有此作用,以党参最为显著,白术次之,茯苓稍差,炙甘草则无作用;除炙甘草外,任两药或三药配伍都能提高小鼠腹腔Mφ的吞噬功能,其配伍基本是相加作用,而炙甘草为-拮抗剂,其拮抗作用与其在配伍中的量有关[80]。巨噬细胞吞噬功能,膜表面Fc受体的活性溶酶体ACP活性可作为巨噬细胞活化程度的指标,四君子汤灌服对正常小鼠以上三项指标均无显著影响,但当用地塞米松(DEX)使巨噬细胞功能受抑制后,本方能显著恢复腹腔MEA花环阳性率及受抑的ACP活性。证明本方从多方面,不同程度上对抗DEX的抑制作用,增强腹腔Mφ的活性[81]。冯氏[82]对用本方治疗秃发患者免疫指标的影响也进行了探讨。另有两篇有关四君子汤的免疫作用的研究报道[83,84]。17。抗肿瘤与抗突变作用用人外周血淋巴细胞以及小鼠骨髓细胞体内培养姐妹染色体互换(SCE)为指标,对四君子汤及其单味药进行抗变研究,结果表明四君子汤及单味人参、白术、甘草均有抗突变效应,而茯苓无此作用[85]。采用盖玻片培养法试验发现,四君子汤的水煎醇提液,对Eca食管癌细胞及肺鳞癌细胞均有抑制分裂的作用,使分裂停止于中期极多,且见癌细胞部分或大部脱落失活,核内染色体凝集。其机制可能是通过细胞内cAMP含量增加以抑制癌细胞DNA的合成,阻止分裂繁殖所致。同样浓度的四君子汤在另一实验中对正常十二指肠器官培养未发现明显损害,而有一定的保护作用,说明四君子汤对正常组织无损害[86]。从四君子汤不同药配伍对胃癌细胞的细胞毒作用的观察中提示,本方有一定的对癌细胞的杀伤作用,其最大的杀伤配伍是四君子汤全方即四药同用[87]。上述实验,说明了四君子汤对癌细胞的直接杀伤作用。本方煎剂,每天灌胃40g/kg,连续给药10d,对小鼠S180荷瘤有明显的抑制作用,可延长腹水型S180小鼠的存活时间[88]。这种作用可能是机体免疫功能提高的结果。在临床上使用抗肿瘤化疗药物时,配合应用本方,以扶正固本,增强机体的抗病能力,将会提高疗效,降低化疗药物的毒副反应。另有报道用本方与环磷酰胺合用对荷瘤小鼠有免疫增强和抑瘤作用[89],对红细胞免疫也有影响[90],宋为民对四君子汤进行了拆方抗变的研究[91]。18。抗实验性溃疡作用四君子汤加黄芪有良好的抗大鼠幽门结扎法溃疡和促进醋酸法慢性溃疡愈合的作用。本方在20g/kg剂量下,能显著抑制胃液的分泌量,减少胃蛋白酶的分泌量,但对胃液总酸度、总酸排出量、胃蛋白酶活性等均无明显抑制作用。本方还能明显增加正常大鼠、幽门结扎模型大鼠和醋酸法慢性溃疡大鼠胃壁粘液糖蛋白量。提示本方抗大鼠实验性溃疡的作用可能与刺激胃粘液的分泌,增强胃粘膜屏障功能有关;而抑制胃酸分泌,减轻攻击因子的作用,可能不是其抗溃疡作用的主要途径[91]。ICR小鼠分为对照组(灌胃生理盐水每日5ml/kg)和用药组(灌胃四君子汤药液每日5 ml/kg或20 ml/kg)连续2d,禁食24 h后常规方法取胃液用pH试纸测胃酸pH值,用Mett氏法测胃蛋白酶活性。结果四君子汤对小鼠胃液量、胃酸pH无明显影响,但能提高胃蛋白酶的活性(P<0。01)[14]。19。对微循环和血液流变学的影响加味党参方四君子汤:由黄芪、陈皮、党参、茯苓、白术、甘草等中药组成,按一定比例配制成100%的水煎剂(1 ml含生药1g)。跑步机:自行设计组装。有四条木板隔开的长60 cm、宽12 cm的转动跑道,可同时跑4只大鼠。为保证大鼠的疲劳程度,确实跑足20 min,我们在每条跑道的尾部的木板上安装电极,用电流调节器控制。当大鼠停止跑动时,即随转动跑道接触电极而受到电击刺激,迫使其继续往前跑而不能停留。造型阶段:造型时间为21 d,造型大鼠单日禁食,在跑步机上跑步20 min,跑步结束时每只灌胃精炼猪油5 ml,100%番泻叶0。4 ml;双日喂白菜,不限量。对照大鼠不跑步,喂普通块料。两组动物均自由饮水,至21 d分别从部分大鼠的心脏、尾动脉取血作指标检查。恢复阶段:即造型动物自然恢复及治疗恢复阶段。将造型大鼠随机分为自然恢复组和药物恢复组。两组从第22 d开始均喂养普通块料,其中药物恢复组(下称给药组)每天灌胃加味四君子汤2 ml,自然恢复组灌胃等量水(下称给水组),观察其恢复情况。于第32 d(即造型后10 d)分别由心脏、尾动脉取血作指标检查,观察药物作用。对全血粘度值的影响[93],见表12-3-51。表12-3-51 加味四君子汤对脾虚大鼠全血粘膜(MPa·s)的影响(±s)全血粘度(1/s)对照组(n=10)脾虚组(n=14)给水组(n=10)给药组(n=14)11。2522。5045。0075。00120。00225。004。870±0。5854。358±0。4203。907±0。3573。633±0。3263。361±0。2533。076±0。1994。094±0。359**3。750±0。260**3。510±0。255**3。410±0。2403。210±0。2503。140±0。2303。387±0。955**3。568±0。738**3。289±0。619*3。141±0。529*3。034±0。5112。912±0。5024。523±0。7224。016±0。6273。663±0。5893。433±0。5093。186±0。3982。999±0。368与对照组比:* P<0。05,* * P<0。01从表12-3-51可见,脾虚组、给水组大鼠的全血粘度在低切变率时比对照组明显降低,差异显著或非常显著(P<0。05～0。01),给药组已恢复正常,与对照组比较无差异。对其他血液流变参数的影响[93]见表12-3-52。脾虚组、给水组的红细胞聚集指数比对照组明显降低,差异非常显著(P<0。01),给水组的比粘度、红细胞比积亦比对照组明显降低(P<0。05)。给药组的红细胞聚积指数已恢复正常,并比脾虚组、给水组升高显著(P<0。01),给药组的比粘度、红细胞比积已恢复正常。表12-3-52 加味四君子汤对脾虚大鼠血液流变参数的影响(x±s) 对照组脾虚组给水组给药组全血粘度(225ys)RBC聚集指数比粘度RBC比积(%)1。102±0。0501。580±0。1372。791±0。24438。680±1。2891。093±0。0441。302±0。109***##2。859±0。22338。960±3。0661。144±0。0911。308±0。151***##2。535±0。304*35。427±3。753*1。154±0。0871。499±0。1072。604±0。32638。650±3。560与对照组比:* P<0。05,* * P<0。01;与给药相比:##P<0。01表12-3-53 加味四君子汤对脾虚大鼠主要脏器湿重影响(x±s)组别鼠数湿 重(g)胸腺脾脏对照组脾虚组给药组给水组152121210。438±0。0930。073±0。024**0。340±0。044**0。273±0。056**##0。692±0。0890。210±0。057**0。560±0。083**0。500±0。074**与对照相比:* * P<0。01;给药与给水比:##P<0。01对胸腺、脾脏湿重的影响[93]结果见表12-3-53,给药组大鼠的胸腺湿重虽然仍低于对照组,但比给水组、脾虚组明显升高,差异非常显著。以四君子汤加黄芪、木香、陈皮组成复方煎剂对大鼠的胃壁微循环和肠系膜微循环进行了观察,结果表明,给药后20min胃壁微静脉明显扩张,毛细血管网交点增多,微动脉在直径20μn以下的微小血管亦呈明显扩张,而对照组未有变化。肠系膜微血管管径在给药后动静脉均有明显扩张,且扩张作用明显优于胃壁血管,同时血流速度加快,毛细血管数给药20min后明显增多,而对照组各项指标均无明显变化[94]。实验也表明本方有明显的抗家兔血小板聚集作用[95],用环磷酰胺造成小鼠血小板减少症模型及脾虚兼血小板减少模型(CY+饮食不节),口服补脾益气方(四君子汤加黄芪)防治。结果表明该方具有明显提高模型小鼠血小板数、缩短出血时间及保护肝脏的作用,其作用显著优于空白对照组和补血对照组[83]。20。增加垂体-肾上腺皮质系统功能给大鼠每日按100mg/kg灌服强的松,连续5d,造成垂成-肾上腺皮质系统功能低下,以肾上腺组织中抗坏血酸含量为指标,用四君子汤加以调整,结果发现,该方有明显对抗外源性激素(强的松)对垂体-肾上腺皮质系统的抑制作用,使大鼠肾上腺组织中抗坏血酸含量降低接近正常水平[96]。取SD大鼠54只,随机分成活血化瘀组、健脾益气组、补肾益精组、IL-1对照组和正常对照组,以上3个用药组大鼠每组10只,分别灌服桃红四物汤、四君子汤和右归饮浓缩煎剂20ml/d。用药剂量为成年人60kg体重剂量的20倍。两个对照组大鼠每组12只,灌服生理盐水2ml。实验大鼠灌服中药复方制剂第7d后行侧脑室插管术,术后单笼饲养,继续喂药至第14d,在安静条件下,将实验大鼠以最小的刺激固定于木架上,移去插管内芯,用塑料管连接微量注射器,以1μl/min的速度缓缓注入IL-1β10μl(5ng/μl),对照组以同样的方式注入生理盐水10μl。30min后迅速断头取血,收集于0。5%EDTA抗凝塑料试管中摇匀、离心,血浆保存于-20℃冰箱中,测定ACTH、皮质酮浓度。结果见表12-3-54、表12-3-55。从表12-3-54可见,侧脑室内注射IL-1β后,血浆ACTH浓度随注射剂量的增加而不断上升,25。0ng组、50。0ng组、100。0ng组与正常对照组比较明显升高(P<0。05或P<0。01)。表12-3-54 不同浓度IL-1β脑室内注射对大鼠血中ACTH的影响(±s)分组鼠数ACTH(pg/ml)正常对照组12。5ng组25。0ng组50。0ng组100。0ng组6666679。2±42。3124。3±101。2215。4±201。1*232。2±119。3**227。1±114。2**与正常对照组比较:* P<0。05,* * P<0。01表12-3-55 3类中药复方对侧脑室内注射IL-Iβ对大鼠血中ACTH、皮质酮的影响(±s)分组鼠数ACTH(pg/ml)皮质酮(ng/ml)正常对照组IL-1对照组桃红四物汤组四君子汤组右归饮组121210101078。7±40。0177。6±115。2**260。0±159。9282。7±162。0△376。1±140。3△△142。77±86。15356。42±39。28**384。84±52。58404。15±74。77△429。58±59。79△△与正常对照组比较:* *P<0。01;与IL-1对照组比较:△P<0。05,△△P<0。01从表12-3-55可见,IL-1对照组大鼠血浆ACTH、皮质酮浓度与正常对照组相比均明显升高(P<0。01),桃红四物汤组大鼠血浆ACTH,皮质酮浓度与IL-1对照组相比均有一定升高趋势,但无统计学意义。四君子汤组大鼠血浆ACTH、皮质酮浓度与IL-1对照组相比较均有明显升高(P<0。05),右归饮组大鼠血浆ACTH、皮质酮浓度与IL- 1对照组相比均明显升高(P<0。01)。研究结果显示,在脑室内注射IL-1前14d用3种不同的中药复方灌胃并与用生理盐水灌胃的正常对照组比较,结果发现,右归饮能使已升高了的ACTH、皮质酮进一步升高,且有明显差异,四君子汤在这一反应状态中也能使已升高的ACTH进一步升高,但对皮质酮没有明显差异,而活血化瘀类中药复方在这一反应状态中没有显示出明显的结果[97]。21。对神经及递质的影响实验证明,本方能减缓利血平化小鼠脑内去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)及其代谢产物5-HIAA含量的下降,但对正常小鼠则无明显影响。认为本方对促进利血平化动物(即动物脑内单胺介质处于低水平的状态时)单胺介质的合成有一定的作用[98]。张氏[99]采用玻璃微电极记录方法,以终板电位(MEPP)、乙酰胆碱电位(Achp)为指标,选取大鼠膈神经-膈肌标本观察,观察了四君子汤及其加味(淫羊藿、枸杞子)提取物对脾气虚大鼠神经-肌肉接头传递的影响。结果表明:脾气虚大鼠MEPP与Achp的振幅明显低于健康大鼠,但其MEPP频率及Achp过程,与健康大鼠相比则无明显差别;四君子汤提取物能使脾气虚大鼠MEPP及Achp的振幅升高(P<0。05),对MEPP频率及Achp时程则没有影响:单纯的淫羊、枸杞子提取物没有如此作用,但四君子汤加淫羊藿、枸杞子的提取物却使脾气虚大鼠Achp的振幅升高更为显著(P<0。01)。以上结果揭示:脾气虚时神经-肌肉接头传递功能将发生障碍,并且障碍可能发生在神经-肌肉接头的突触后膜。健脾益气方药四君子汤可以增强脾虚时神经-肌肉接头的传递功能,补肾壮阳药淫羊藿、枸杞子有增强四君子汤改善脾气虚时神经-肌肉接头传递障碍效应。四君子汤对脾虚模型家兔神经内分泌功能变化有调整作用[100]。22。对四物汤、四君子汤和六味地黄汤中铁、锌、铜的吸收陆氏比较了四物汤、四君子汤和六味地黄汤中铁、锌、铜的吸收程度,并从这方面讨论微量元素和复方临床疗效的联系。结果麻醉大鼠小肠灌注复方煎剂后对铁的吸收量分别为四物汤118。8±34。6μg,四君子汤为5 7。4±24。3μg,六味地黄汤为18。83±11。22μg;对Zn的吸收量分别为73。7±26。2μg,31。9±9。3μg,49。01±12。11μg;对铜的吸收量分别为28。4±14。9μg,8。3±2。5μg,6。55±2。88μg。四物汤中Fe和Cu的含量及吸收量都较高。Fe的吸收量四物汤分别比四君子汤和六味地黄汤高出1。07倍和5。27倍。Cu的吸收量四物汤是四君子汤的3。4倍。各复方组诸元素的吸收速度常数均无明显差异。以上结果提示,四物汤中Fe和Cu含量高,且Cu的利用率高,可能与其补血作用有关[101]。张氏[102]等也观察了本方对气虚模型小鼠血清微量元素量的影响。23。其他体外抑菌实验表明,对伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌、弗氏痢疾杆菌、大肠杆菌均有不同程度的抑制作用[103]。还可显著抑制由于强的松连续口服所致大鼠肾上腺中维生素C含量升高,使维生素C含量恢复至正常水平。提示本药对肾上腺皮质对肾上腺的反馈抑制有显著的调整作用。【药代动力学研究】1。对脾虚模型胃动素及川芎嗪药物动力学的影响[104]遗传基因的组成不同可构成不同的个体药物动力学(PK)特征。任平等观察了脾虚证大鼠血浆和肠组织中胃动素(MOT)的含量及其磷酸川芎嗪(TMPP)的药物动力学(PK)特征,并用四君子汤反证。雄性Wistar大鼠180只,体重220。0±13。7g,鼠龄5个月,随机等分为3组,每组60只,造模时间14d。正常对照组:每只生理盐水0。2ml/d股四头肌肌肉注射,同时灌服蒸馏水2ml/d;脾虚模型组:利血平1mg·kg-1·d-1肌肉注射,灌服蒸馏水2ml/d,隔日测体重、体温等,于第4d出现的症状;四君子汤反证组:利血平用量用法同上,灌服四君子汤水煎液(人参:炒白术:茯苓:炙甘草为2:2:2:1,配制成200%水煎液,每毫升约含生药2g,2ml/d。动物在结束造模后,禁食1夜,次日以戊巴比妥钠麻醉,剖腹,腹主静脉取血2ml,同时在十二指肠与空肠交界处下1cm处取0。5cm长的肠组织,立即液氮冻存。血标本置含有100%依地酸二钠(EDTA 2Na)30μl和抑肽酶30μl的试管中,4℃离心(3500r/min)15min,取血浆-20℃保存。小肠组织称重后加入预冷1N醋酸0。5ml,煮沸10min,匀浆,4℃离心,取上清液-20℃保存。采用竞争性放射免疫非平衡法放射免疫分析。测定中自设质量控制管。数据经微机处理,得如下参数:批内差异4。73%,批间差异9。12%;非特异性结合率3。61±0。40(%),零标准结合率49。30±0。69(%);相关系数-0。994～-0。998。3组大鼠在停用各种药物24h后,TMPP于灌胃前及其后的0。083、0。5、1、3、5、8、12和24h分别断头取血0。2ml或0。1ml,制成样品待测,每个时间点处理6只大鼠,每组测8个时间点(6只×8)。用残数法、梯形法和非线性最小二乘法处理药物浓度一时间数据,分析判别房室模型及药动学参数,统计学处理采用随机资料t检验。3组大鼠MOT的含量变化:见表12-3-56。脾虚模型组大鼠小肠组织和血浆中MOT的含量明显高于正常对照组和四君子汤组大鼠,而正常对照组和四君子汤组大鼠之间MOT含量无明显差异,且这一结果与临床资料相符,表明该模型制作较为成功,结果可靠的。表12-3-56 3组大鼠大肠组织、血浆中MOT含量变化(±s)组别鼠数MOT小肠组织(ng/g湿重)血浆(ng/L)正常对照组脾虚模型组四君子汤组60606034。37±4。3219。86±5。04**△△35。09±1。9889。84±4。1757。39±7。11**△△88。67±6。43注:与正常对照组比较:* * P<0。01;与四君子汤组比较:△△P<0。013组大鼠TMPP的PK参数比较:见表12-3-57。在正常对照组与脾虚模型组大鼠之间对照这些参数中除峰值时间(Tp)和表观分布容积(VFc)外,均有显著的差别(P<0。01),而四君子汤组与正常组差别不明显。表12-3-57 3组大鼠的TMPP PK参数比较(±s)项 目正常对照组脾虚模型组四君子汤组α(h-1)β(h-1)Ka(h-1)K10(h-1)K12(h-1)K21(h-1)t1/2kα(h-1)t1/2α(h-1)t1/2β(h-1)AUC(μg·hml-1)Tp(h)Gmax(μg/ml)VFc(μg/ml)2。83±0。700。22±0。025。41±1。910。88±0。201。45±0。470。72±0。220。14±0。090。27±0。113。19±0。345。20±2。570。30±0。052。33±1。172。81±1。300。38±0。09**0。06±0。30**13。61±2。56**0。24±0。07**0。11±0。02**0。11±0。02**0。05±0。04**1。92±0。44**13。35±5。93**24。88±9。76**0。34±0。034。82±1。23**2。03±0。582。33±0。650。24±0。055。28±1。390。82±0。111。39±0。680。77±0。080。16±0。100。31±0。093。21±0。285。11±6。810。33±0。022。18±1。142。19±0。98注:与正常对照组比较,**P<0。01;每组均为6只动物;α代表α分布相表观一级吸收速度常数β代表β分布相表观一级吸收速度常数,Ka代表表观一级吸收速度常数,K10代表中室表观一级吸收速度常数,K12代表表现一级室间转运速度常数,K21代表表观一级室间转速度常数;t1/2kα代表半吸收期,t1/2α代表α相半衰期,t1/2β代表β相半衰期,AUC常数代表血药浓度-时间曲线下面积,Cmax代表血药最高峰浓度3组大鼠TMPP灌胃后的血清药物浓度—时间关系见表12-3-58。结果表明脾虚模型组的血药浓度显著地高于正常对照组,四君子汤组大鼠仅两个时间点(0。5h和12h)明显高于正常组大鼠,余均与正常相近;且这些结果在12h之前与已有研究十分近似,说明实验结果的重复性良好。表12-3-58 3组大鼠TMPP(10mg/kg)灌胃后的血清药物浓度-时间值比较(μg/ml,±s)组别0。083h0。50h1。00h3。00h5。00h8。0Dh12。00h24。00h正常对照组脾虚模型组四君子汤组1。24±0。562。03±0。37**1。80±0。722。18±1。154。58±0。72**3。28±0。99*1。20±0。673。78±0。70**2。57±0。620。46±0。322。17±0。65**1。74±0。490。28±0。181。46±0。34**1。19±0。230。14±0。080。65±0。21**0。61±0。160。05±0。010。40±0。17**0。30±0。09*00。17±0。08**0。14±0。02注:与正常对照组比较:* P<0。05,* *P<0。01;每组每个时间点均为6只大鼠大鼠灌胃TMPP(10mg/kg)后的最后1次取血时间由12h延至24h,使前文TMPP在脾虚证的房室模型为一室模型、正常组为二室模型的结果变为TMPP在脾虚证、正常和四君子汤治疗大鼠的房室模型均为开放型二室模型。在本实验条件下,大鼠在肌肉注射利血平同时灌服四君子汤,未出现类似脾虚证的证候,且MOT含量、TMPP的PK参数及血药浓度等与正常对照大鼠均无显著性差异,而未服四君子汤的脾虚模型组大鼠则与正常对照组和四君子汤组大鼠有显著性差异(P<0。01)。表明:造模方法成功;脾虚模型大鼠TMPP的PK特征是由脾虚所致;四君子汤可改善脾虚模型大鼠的临床症候,升高MOT,从而改变脾虚模型大鼠TMPP的PK特性。口服药物的吸收靶部分主要在胃肠,尤其是生物碱类微碱性药物主要在小肠中吸收;TMPP为生物碱的脂溶性药物。脾虚时小肠及血浆MOT含量下降,小肠蠕动减弱,TMPP在小肠停留的时间延长,将使吸收靶部位周围TMPP的浓度增高,根据Fick第一定律:吸收速率与胃肠道内药物浓度成正比关系,因而脾虚时TMPP的吸收速率(Ka、t1/2kα)加快,进而TMPP的血药峰浓度(Cmax)和血药浓度——时间曲线下面积(AUC)显著增加,生物利用度也增高;同时由于脾虚,运化功能减弱,可致TMPP输布和排泄(α,K12,K21,K10,β和t1/2β)减慢。2。甘草甜素血药浓度及其药代动力学研究[105]分谱条件:色谱柱:IntersileODS-3,150mm×4。6mm,5μ。流动相:甲醇-水-醋酸(80:19:1),流速:1。0ml/min;检测波长:250nm。溶液配制:甘草甜素标准液:精神称取:甘草甜素×对照品1。5mg左右,用10%甲醇水溶液定容于50ml容量瓶中,得其标准浓度为30。6μ/ml;内标液:准确称取一定量之联苯,以10。甲醇水溶液定容,使其最终浓度为10。056μg/ml。四君子汤药液:取冻干粉剂4。95g,准确加入16。0ml水即配成含生药3g/ml的灌胃药液。样品制备:将SD大鼠在室温下(20℃左右)饲养5d,给予正常光照,用药前空腹24h,饮水不限。取四君子汤以生药30g/kg剂量按大鼠体重灌胃,分别于0。5、10、20、30、60、90、120、240和360min等不同时间颈动脉插管取血,将血置于肝素化离心塑料管中,混匀,台式离心机8000r/min离心10min,取上清,同法不灌胃取空白血浆,冷冻至-20℃冰箱保存待用。样品预处理:取10μl血浆,加入20μl内标液后加入甲醇至50μl,电动混匀器充分混匀1min,台式离心机8000r/min离心10min,取上清20μl进样。标准曲线:取大鼠空白血浆各100μl于塑料离心试管中,加入不同体积甘草甜素标准液,其所含甘草甜素分别为122。4、244。8、483。2、2。966、1932。8和3865。6ng,分别加入20μl内标液,充分混合加入一定体积的甲醇,使总体积为500μl,照“样品预处理”项下损伤。以甘草甜素与内标峰面积比(Y)对甘草甜素的量作线性回归。甘草甜素血药浓度测定:取出已制备的大鼠血浆样品室温下融化后按“预处理”项下操作,按内标法以标准曲线定量。在上述色谱条件下,甘草甜素和内标的保留时间分别为4。0min和8。5min,分离完全,空白血浆中无干扰物质。标准曲线:A=0。250±0。0079,B=0。0003±0。00005(n=5),r=0。9934,表明在122。4～3865。6ng之间线性关系良好。最低检测限和最低检测浓度:以机器鸣声的3倍以界(S/N=3),最低检测线为2ng,最低检测浓度为0。228μg/ml。回收率及精密度:取线性范围内不同浓度,分别测定其回收率和日内及日间精密度,平均回收率为97。22%±4。16%,平均日内精密度为4。16%±0。335%,平均日间精密度为6。90%±2。55%,回收率和精密度均较好。样品测试:按样品制备方法和预处理方法分别测定各时点的血药浓度。药力动力学:经3P87药动学数据处理软件对以上数据拟合。结果:大鼠血浆中甘草甜素浓度在1。224μg/ml至38。655μg/ml,线性关系良好。四君子汤灌胃甘草甜素在大鼠体内药时过程符合二房室开放模型,吸收和分布较为迅速,排泄缓慢。结论:所建立的反相HPLC法灵敏、可靠、迅速,可较好地用于甘草甜素体内的吸收代谢研究以及甘草制剂等的测定。【临床应用】1。治疗呼吸道疾病陈氏[106]应用组胺丙种球蛋白(以下简称组胺丙球)配合四君子汤加黄芪防治喘息型支气管炎90例,取得一定疗效。其中男54例,女36例,男女之比1。5:1。年龄自10个月～6岁,其中1岁以下8例,～2岁24例,～3岁25例,～4岁10例,～5岁11例,～6岁12例。3岁以下占一半以上。咳嗽、喘息反复发作半年～1年占16例,～2年42例,～3年19例,～4年12例。曾有过敏性疾病或食物、药物过敏史15例,占16。7%,家族一、二级亲属有哮喘史13例,占14。4%。本组绝大多数病例是因感冒而引起咳嗽、气足、喘息等症状。少数因接触过敏源而诱发发作。有反复发作史,发作时较难控制,一般要使用质皮激素后才能使病情控制,部分有发热,无紫绀,肺部体征有喘鸣音或干啰音,呼气延长,少数有不固定的的中等水泡音。治疗方法:冻干组胺丙球用法:临用时用注射用水2ml稀释组胺丙球1支,肌肉注射,12d1次,6次为1疗程。在哮喘缓解期使用,用药期间忌用皮质激素、酮替芬及其它干扰免疫功能的药物。如有感冒、喘息发作,给予抗感染,舒喘平,氨茶碱等对症处理,治疗期间,每天配合四君子汤+黄芪1剂煎汤口服。疗效判断:显效:1年内不发作,偶有轻咳,低热,但无喘息,肺部听诊有少许痰鸣音,对症处理很快消失。好转:1年内发作次数明显减少,不超过3次,发作时,症状轻,肺部有少许痰鸣音或喘鸣音,经一般性治疗得以控制,疗程不超过5d。无效:治疗前后病情无明显变化,或1年内喘息发作4次以上。疗效分析:90例均治疗1疗程,显效33例,占36。7%,好转51例,占56。7%;无效6例,占6。7%;有效率93。3%,6例无效患儿家族一、二级亲属有哮喘史。其中1例在接种“百破疫苗”后1d发生喘息,其它病例无不良反应。蒙氏[107]运用加味四君子汤配合西药治疗慢性呼吸衰竭失代偿谢66例,并以同期单纯西药治疗33例为对照。全部病例为住院病人,治疗组中医辨证均属脾肺气虚,肾不纳气。治疗组男性39例,女性27例,年龄52～81岁,平均66岁。对照组男性21例,女性12例,年龄49～82岁,平均67。2岁。治疗前症状、体征积分,治疗组16。38±6。42分,对照组15。82±5。84分。经统计学处理,以上两组积分无显著性差异,P>0。05,具有可比性。治疗方法:治疗组为加味四君子汤治疗(红参10g,白术12g,茯苓12g,炙甘草6g,黄芪15g,胡桃肉10g)。先煎红参至100ml,余药浓煎至200ml,混合一起,分3次口服,继续观察7d,治疗组与对照组均采取同一西医药治疗方案(吸氧,输液,使用呼吸兴奋药及抗生素等)。观察指标:a。详细记录患者喘促、神志、紫绀、水肿、心率(律)的变化情况,以积分法分析疗效。参照《新药临床研究指导原则》中的积分法,按症状体征轻重分为3级,其中+者记2分,?者记4分,?者记分6分。b。记录治疗前后血常规,血气分析中的PaO2(kPa),PaCO2(kPa)以及心电图等。结果:两组疗效比较,加味四君子汤治疗组66例,显效29例(29/66),占43。94%,好转22例(22/66),占33。33%,无效15例(15/66),占22。73%,总有效率77。27%。对照组33例,显效7例(7/33),占21。21%,好转7例(7/33),占21。21%,无效19例(19/33),占57。58%,总有效率42。42%。两组统计学处理(Ridt分析),P<0。01,显示出治疗组疗效明显好于对照组。以全部有效病例(治疗组51例,对照组14例)之动脉血气分析作对照(均抽取股动脉血作检查)。治疗前,两组病例之动脉血气分析(PaO2,PaCO2)比较,经统计学处理,差异均无显著性(P>0。05),说明两组具有可比性,治疗后,两组氧分压均明显上升、二氧化碳分压增多有所下降,但治疗组均明显优于对照组(P<0。05)。2。治疗冠心病、心绞痛、高血压本方加丹参、陈皮、赤芍、麦冬等治疗冠心病30例,30剂为1疗程,结果:心电图显效10例,改善3例,无效9例。治疗心绞痛28例,显效10例,改善15例,无效3例;高血压9例,恢复正常8例,无变化1例[108]。冯氏[109]用加味四君子汤治疗阳虚胸痛18例,有较好疗效。18例胸痛患者,均系男性,年龄23～33岁6例,34～44岁9例,45岁以上3例。其中有外伤史1例,劳伤史3例。病程最短2d,最长8d。主要表现为面色黄白,神疲乏力,食欲减退,气急促,胸闷痛,舌质黯淡,舌苔薄白,脉沉滑。治疗方法:人参、茯苓、白术、甘草、乳香、没药、桂枝。如疼痛较重加五灵脂、延胡索;气促胸闷明显加木香;身困乏力显著加重茯苓用量,并加砂仁。结果18例服药最短2d,最长4d,平均3d,全部治愈。3。治疗消化系统疾病3。1 治疗复发性口腔溃疡刘氏[110]用本方加味治疗复发性口腔溃疡312例,男118例,女194例;年龄4～54岁。病程2d～3+年。单发83例,多发229例,溃疡直径多为2～6mm,个别大的可达11 mm。伴有发热21例,不思饮食的有291例,大便溏薄或完谷不化的257例。有178例曾用过B族维生素和葡萄糖酸锌等治疗,效果欠佳。治疗方法:四君子汤基本方:党参12g,白术15g,茯苓20g,甘草8g。加味:食积较明显,舌苔白滑者加鸡内金、山楂。胃热较明显,苔厚腻的加生石膏(先煎)。脾阳不振,大便完谷不化或溏薄,舌淡胖者加川厚朴、肉豆蔻。肝经湿热,颧红口苦者加山栀子、白芍、生苡仁。如脾肾阴虚,水不济火,阴虚火旺,心火上炎,舌尖红,脉细者,加黄柏、知母、麦冬。用法:水煎服,每日1剂,复煎再服,小儿剂量酌减,7d为1疗程,最多治疗2个疗程。痊愈(服药1个疗程以内,溃疡消失,随访半年无复发)255例。显效(服药2个疗程以内,溃疡消失,随访半年,复发1～2次,再服药溃疡仍可愈合,并不再复发者)44例。无效(经治疗2个疗程,溃疡不愈合,或愈合,但不久又复发者)13例。总有效率95。8%。3。2 治疗食管炎将78例反流性食管炎按中医辨证分为虚寒、气滞、瘀阻、痰浊等。以氢氧化铝乳剂和庆大霉毒注射液口服,并以四君子汤合温胆汤加减治疗,疗程1个月,获得满意疗效,临床症状消失和粘膜恢复正常均达81%[111]。3。3 治疗胃炎、溃疡病和胃脘痛以四君子汤加减治疗脾胃气虚型胃脘痛125例,结果治愈86例,显效22例,好转17例,总有效率100%。部分病人存在程度不同的低蛋白血症,治疗后绝大多数得到纠正。大便潜血阳性者42例,仅有少数仍为轻度阳性;胃镜检查治疗后阴转率为88。4%,钡餐阴转率为63。2%[112]。以四君子汤为主,治疗胃、十二指肠溃疡患者,中医辨证属脾虚型,加黄芪、香附、煅瓦椤、陈皮,脾虚肝郁加白芍、川楝子、佛手、木贼等。结果13例脾虚者,痊愈8例(61。5%),显效3例(23。1%),好转2例(15。4%);脾虚肝郁型20例,痊愈11例(55%),显效8例(40%),无效1例(5%),总有效率95%[113]。该方加黄芪、三棱、乌贼骨为基本方治疗十二指溃疡病人,证属脾虚型者用基本方治疗;脾虚肝郁型用基本方加柴胡、白芍、大黄等,每日1剂,部分病人服丸剂,4～8周为1疗程,结果:脾虚型57例,痊愈30例,显效12例,好转13例,无效2例[114]。该方加黄芪、五灵脂、香附治疗肝虚血瘀型消化性溃疡100例,结果:胃和十二指肠溃疡的治愈率为77%和74%,总有效率为97%[115]。本方随证加味治疗胃脘痛38例,治愈26例,有效12例[116]。该方加黄芪、山楂、陈皮、制附片为基本方随证加减治疗虚儿肠胃疾患(腹泻、腹痛、腹胀、恶心呕吐、胃脘痛)40例,结果显效34例,好转5例,无效1例,总有效率97。5%,服药最少者2剂,最多4剂[117]。以本方治疗脾气虚型胃肠病患者60例,服药平均为29。3剂,治疗前后测定血清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA),结果:临床显效27例(45%),有效30例(50%),无效3例(5%),总有效率为95%。治疗前SOD显著低于正常,MDA明显高于正常,治疗后两者与正常无明显差异,说明该方有清除自由基,降低脂质过氧化反应[118]。以四君子汤为主加味治疗胃粘膜脱垂30例,经临床症状和胃镜检查评定,结果治愈16例,显效8例,有效6例[119]。李氏[120]用本方合西药治疗老年慢性胃炎26例效好。邹氏对慢性胃病脾虚兼肝郁证患者用本方治疗,并测定了胃电的改变[121]。庄氏[122]应用四君子汤加味合阿莫西林、洛赛克的中西医结合治疗方法,对十二指溃疡(活动期)、HP阳性病人进行了临床治疗观察,并与单用西药治疗组作了对比观察。观察病例245例,均经纤维胃镜及病理检查确诊为十二指肠溃疡、HP(+)患者。其中男135例,女110例;年龄17～68岁,平均35。7岁;病程1个月～15年。病人中单发溃疡173例,多发溃疡58例,复合性溃疡14例,合并上消化道出血者17例,全部病人均合并有慢性浅表性胃炎。将病人随机分为2组,治疗组132例,对照组113例。治疗组:西药治疗同对照组,另合四君子汤加味治疗。处方:党参、蒲公英、海螵蛸各20g,茯苓、白术、浙贝母、连翘各15g,炙甘草、三七各10g。每天1剂,水煎,晚睡前服,第2d复煎空腹服,连服1个月。对照组:口服洛赛克20mg,每天2次;阿莫西林0。5g,每天3次,连服1个月。2组病人均在治疗1个月后复查胃镜及HP,并统计治疗结果。2组治疗结果对比见表12-3-59。表12-3-59 2组治疗结果对比[例(%)] nHP转阴溃疡愈合溃疡好转治疗组对照组132113125(94。7)**83(73。5)130(98。5)**98(86。7)2(1。5)15(13。3)与对照组比较:**P<0。013。4 治疗肝炎以本方加味治疗15例迁延性肝炎,均获满意疗效。徐氏报道,用本方加黄芪为基础方治疗慢性活动性肝炎40例,随证加减,经4～5月治疗均获痊愈。其中HBsAg转阴28例,占70%;HBsAg滴度下降6例;免疫学指标、肝功能及生化指标均恢复正常。胡氏将本方加生石膏作为基础方,然后针对患者的具体情况加味辨治,治疗慢性肝炎及乙型肝炎取得了满意的效果[32]。另有以本方加姜半夏、陈皮、砂仁治疗肝炎,常在黄疸型肝炎黄疸消退,转氨酶恢复正常,TTT、麝浊等指标延迟未复的情况下使用,认为此期病情往往是湿热退后,脾胃功能尚未恢复,用此方可健脾益气助消化,同时利用运化的健旺而除余湿,临床效果甚佳[123]。陈氏以本方加味治疗小儿乙型肝炎20例,连服30剂,结果近期治愈16例,占80%;好转4例,占20%[32]。朱氏用本方加减治疗乙肝33例[123]。本方加当归、白芍、柴胡治疗慢性肝炎100例,服药40～60剂,结果:痊愈61例,好转31例,无效8例[124]。3。5 治疗结肠炎结肠炎:以本方加黄芪、当归、元胡、木香等制成健脾灵片剂,治疗慢性溃疡性结肠炎60例,日服9片分3次服。近期治愈40例(66。7%),显效13例,好转5例,无效2例。对照组26例,服柳氮磺胺吡啶片1g/次,4次/d。近期治愈8例(30。8%),显效8例,好转7例,无效3例,本组疗效高于对照组[126]。以本方为主加减治疗肠道易激综合征51例,显效39例,好转14例,无效4例,总有效率为92。9%[127]。郝氏用思密达与本方合用治疗慢性结肠炎疗效好[128]。3。6 治疗上消化道出血四君子汤合芍药甘草汤、半夏泻心汤化裁治疗脾虚不摄型和脾虚寒热相挟型上消化道出血62例,显效21例(33。9%),有效36例(58。1%),总有效率91。9%[129]。梁氏[130]将收治的吐血、黑便(急性上消化道出血)病人120例,随机分为4组,治疗组分别为四君子汤加藕节合剂口服液组(A组)30例、四君子汤加藕节合剂片组(B组)30例、四君子汤加藕节合剂颗粒组(C组)30例,对照组甲氰咪胍组(D组)30例。治疗前情况见表12-3-60,表12-3-61,表12-3-62。表12-3-60 性别与年龄 男女15～40岁41～55岁>56岁四君子汤+藕节口服液组四君子汤+藕节片剂组四君子汤+藕节颗粒组甲氰咪胍组21201919910111112141412121211136455表12-3-61 四君子合藕节制剂各组黑便、吐血黑便及原发病情况 黑便吐血黑便十二指肠球溃胃溃炎症其他四君子汤+藕节口服液组四君子汤+藕节片剂组四君子汤+藕节颗粒组甲氰咪胍组24252526655423202122243335432122表12-3-62 四君子合藕节制剂各组出血程度与血红蛋白量情况 重度中度轻度血红蛋白g/L四君子汤+藕节口服液组四君子汤+藕节片剂组四君子汤+藕节颗粒组甲氰咪胍组5555131213121213121386。387。587。189。14组病例在年龄、病情等方面基本相同,具可比性。治疗方法:藕节合剂3种剂型每剂均含藕节生药6g,田三七1。5g。3种剂型均按常规工艺制备。口服液组,每日4次,每次10ml。片剂组,每日4次,每次3片。颗粒组,每日4次,每次1。6g。以上3组均同时给予口服四君子汤(党参30g,白术、茯苓各15g,甘草6g)煎剂,每日1剂。甲氰咪胍组,每日2次,每次0。6g,加入输液中。轻、中度出血者,每天输液1,000～1,500ml,重度出血者并给予输血300～600ml。疗效评定标准:按全国血证急症协作组制定的标准。痊愈:1周内吐血或黑便停止,大便潜血试验阴性。显效:1周内吐血或黑便停止,大便潜血试验(+)。有效:1周内出血减少,大便潜血试验(?)。无效:经治1周,出血不止;重度出血,经24h后无好转甚至加重;大便潜血试验阳性无变化。治疗结果见表12-3-63。表2-3-63 四君子汤治疗吐血、便血的疗效 痊愈显效有效无效总有效率潜血阴转天数四君子汤+藕节口服液组四君子汤+藕节片剂组四君子汤+藕节颗粒组甲氰咪胍组2423232233231232222393。3%93。3%93。3%90%3。843。863。875。14各治疗组与对照组总有效率基本相同,P>0。05;治疗组各组止血时间基本相同,P>0。05;但与对照组甲氰米胍组的止血时间比较有极显著差异,P<0。01。本方加用锌制剂治疗小儿厌食症效好[131]。4。辅助治疗癌症腹泻是消化道肿瘤术后常见的并发症之一,严重地影响着术后病人的康复,同时也消弱了机体抗癌能力。本病用抗生素类药物多难奏效,杨氏用半夏泻心汤合四君子汤治疗43例均获痊愈。43例中男32例,女11例;最大年龄68岁,最小年龄34岁;贲门癌11例,胃癌18例,食管癌7例,肠癌7例;病史最长1。5年,最短2个月;腹泻少者日2次,多者日3～5次;服药时间短者1周,长者2个月,一般为4周。43例病人均为服用抗生素类药物而未能治愈者。治疗方法:用半夏泻心汤合四君子汤:清半夏10g,干姜10g,黄连10g,黄芩6g,大枣3枚,炒白术10g,茯苓15g,太子参15g,甘草10g。日1剂,水煎服。服中药期间停服其他止泻药物。治疗结果:腹泻停止、大便成形后,随访1个月未复发者为治愈。43例病人均治愈[132]。另有报道用本方结合化疗、放疗或手术治疗肺癌、肝癌、胃癌、癌前病变等报道[133～137]。5。治疗脾虚体弱以四君子汤为基础加减治疗小儿感染后脾虚综合征404例,结果痊愈128例(31。7%),显效76例(18。8%),好转158例(39。1%),无效42例(10。4%),总有效率为89。6%[137]。以本方加芍药、葫芦茶等药制成参苓健儿膏,治疗脾胃虚弱或脾肺两虚所致胃纳欠佳、大便稀烂、汗多、消瘦、容易感冒等体弱儿童有较好疗效。经1～3月治疗,结果:显效193例(54。2%),有效148例(41。6%),无效15例(4。2%)。患儿服药后,体重、血红蛋白、末梢血E-玫瑰花结形成率、PHA皮试红斑直径和3种免疫球蛋白的均值均显著增加,对照组患儿服安慰剂,服用前后其体重、血色素、PHA皮试红斑直径等均无明显差异,在相同时间内,体弱儿服药组体重增加均值明显高于健康儿未服药组[139]。6。其他用四君子汤合寿胎丸加减治疗胎动不安,每日1剂,治疗2周,结果治疗200例中,痊愈188例(94%),无效12例(6%)[140]。本方加黄芪、白扁豆可治疗痔漏下血不止、面色萎黄、心悸、耳鸣、足软乏力及一切脾虚口淡无味之症,对中气虚弱不能摄血,症见便血、崩漏不禁者亦有效[141]。本方加减治疗全身性“脂肪肿”[142]。合五子衍宗丸治疗遗尿证[143]。合封髓丹加减治疗乳糜尿。本方配合推拿法治疗膝关节滑膜炎均获得良效[144]。本方加味还可治疗脾气虚证[145]、药物性血尿[146]、小儿低热[147]、滑胎[148]及不孕证等疾病[149～151],均获效。
