??76。龟板 鳖甲 : 【中医理论】龟板10～15g,鳖甲10～15g为临床常用剂量和药对。龟板甘咸平,偏于人肾通心,滋阴养血,清热潜阳,大补之力大于鳖甲。鳖甲咸微寒,偏于人肝,益阴退热,破血通络,散结之力大于龟板。龟板人血分,能补血止血,益肾健骨,又能开骨催产;鳖甲入阴分,善搜阴分热邪而清虚热,又能破瘀散结。两药合用,滋阴潜阳,清热散结,用治温热病高热经久不退,阴伤液耗,虚风内动,手足蠕动,舌干无津,午后低热,夜间烦躁,或骨软骨弱。方如三甲复脉汤。【药理研究】1。氨基酸的测定[1]样品处理:龟板样品和鳖甲样品均按《中华人民共和国药典》1985年版一部的规定处理,研粉后过100目筛,备用。游离氨基酸的测定:取上述样品各100g,分别置于500ml渗漉筒中,用30%乙醇渗漉。收集渗漉液至无茚三酮反应为止。用稀盐酸调至pH6～7,再分别通过阳树脂柱。用蒸馏水洗至中性,然后用5%氨水洗脱。收集洗脱液至无茚三酮反应为止。减压去氨,水浴浓缩至一定体积,过滤。转入100ml容量瓶中,用水稀释至刻度,即生药与提取液之比为1:1(g/ml),摇匀,作为供试品溶液。精密量取上述供试品溶液各0。5ml,依次装样,自动吸收50μl上机测定。分析柱:2。6mm ID×250mm;脱氨柱4mm ID×50mm;树脂:2619,流动相:IpH-1～4缓冲液(pH3。3、pH4。3、pH4。9);柱温:55℃;流量与压力:缓冲液0。275ml/min(125g/cm2)、茚三酮0。3ml/min(25kg/cm2);检测:茚三酮显色,双波长比色计(570、440nm);分析周期72min。测定结果见表12-76-1。盐酸水解后氨基酸的测定:精密称取上述样品各50mg,置于50ml玻璃安瓿中。准确加入6M HCl20。00ml,抽真空封管,于110±1℃条件下水解24h。取出摇匀,放凉,开管。精密吸取水解液1。00ml,在约60℃下减压挥干。加入0。8 ml蒸馏水,再减压挥干。加入0。01M NaOH 0。5 ml,室温下敞口静置4 h后,移入5ml容量瓶中。加0。02M HCl至刻度,摇匀,作为供试品溶液。测试条件和方法同游离氨基酸测定项下。测量结果见表12-76-1。表12-76-1 龟板、鳖甲中氨基酸的测定氨基酸游离氨基酸水解后氨基酸龟板鳖甲龟板鳖甲天冬氨酸苏氨酸丝氨酸谷氨酸甘氨酸丙氨酸胱氨酸缬氨酸蛋氨酸异亮氨酸亮氨酸酪氨酸苯丙氨酸赖氨酸组氨酸精氨酸膊氨酸总氨基酸Asp。Thr。Ser。Glu。Gly。Ala。Gys。Val。Met。Ile。Leu。Tyr。Phe。Lys。His。Arg。Pro。A。A20。189。5915。8550。6083。9139。022。8111。962。378。7313。401。559。9514。041。9429。9348。97364。60132。9062。54111。99262。09260。43238。074。0157。6111。8940。0872。1712。0258。2387。369。24188。03261。931644。62144058010402600495019809056018044087043053074026017602670211201710750125030003040221090680280530102038065098031020202970219102。浸出物、总氮量和总灰份的测定[1]取样品粉末各适量,按《中国药典》1985年版一部附录的法定方法,分别测定其水浸出物、70%乙醇浸出物、总氮量和总灰份。测定结果见表12-76-2。表12-76-2 龟板、鳖甲浸出物、总氮量物和总灰份品名水浸出物(%)乙醇浸出物(%)总氮量(%)总灰份(%)龟板鳖甲7。015。802。982。144。234。9153。3852。803。微量元素分析分别精密称取各样品粉末1 000 g,依次加入10 ml浓硝酸,置于高压釜中,在150℃左右条件下硝化2 h。过滤,移入100 ml容量瓶中。用蒸馏水稀释至刻度,备用。用等离子发射光谱法测定Mn、Cu、Zn、P、Mg、K、Ca、Al、Na等11种元素,用原子吸光谱法测定As、Se、Cd、Pb、Hg5种元素。测量结果见表12-76-3[1]。表12-76-3 龟板、鳖甲微量元素含量(μg/g)元素龟板鳖甲CrMnCuZnPMgFeKCaAlNaAsSeCdHgpb5。010。03。554。017。0×1031784。5173。52070。5202。5×10351。03894。50。62。71。5<0。01(ppb)2。05。026。55。09。118。3×1031695。0320。02045。0203。5×10380。04426。50。52。31。5<0。01(ppb)0。2【药理研究】1。免疫作用1。1 对免疫器官重量的影响[2]取小鼠50只,体重18±1g,雌雄各半,按性别随机分成5组。第1,2组灌服不同剂量龟鳖丸混悬液;第3组灌服双宝素;第4组灌服水;每日1次,连续6d。给药后第4d腹腔注射环磷酰胺60mg/kg;第5组为正常组。第7d称体重后处死,取胸腺和脾脏精密称重,并计算胸腺指数和脾脏指数。进行t检验,结果见表12-76-4。表12-76-4 龟鳖丸对小鼠免疫器官重量的影响n=10组别剂量(g/kg)胸腺指数(mg/10g体重)脾脏指数(mg/10g体重)P龟鳖丸+CY龟鳖丸+CY双宝素+CY水+CY60。61。621。28±3。89**18。86±3。62**18。57±4。56*13。77±3。9251。33±5。03**46。76±6。87*47。23±6。94*38。85±7。73<0。01<0。05<0。05正常组 23。79±3。74△△△60。16±5。65△△△<0。001正常组与对照造模组比较:△△△P<0。001;治疗组与对照组比较:* * * P<0。001,* * P<0。01,* P<0。05金氏[2]取小鼠体重10～13 g,随机分组,分别按0。6 ml/20 g灌胃给药。对照组给以等体积水,每天1次,连续10d,于末次给药后30 min处死小鼠,摘取胸腺及脾脏,称湿重并计算其指数。结果见表12-76-5。表12-76-5 龟鳖养生丸对未成年小鼠免疫器官重量的影响(±s)组别动物(只)剂量(g/kg)胸腺指数(mg/kg体重)脾脏指数(mg/kg体重)对照组12♂—42。43±4。9062。57±5。16黄芪组龟鳖养生丸组龟鳖养生丸组12♂12♂12♂206349。34±5。53**49。58±5。21**49。64±5。54**80。42±8。00**83。70±8。00**79。74±15。18**与对照组相比:**P<0。011。2 对细胞吞噬功能的影响1。2。1 对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响[2]小鼠体重18～22g,随机分组,分别0。6mg/20g灌胃给药。对照组给以等体积水,每天1次,连续10d,末次给药后30min,腹腔注射2%(v/v)鸡红细胞0。5ml/只,2h后处死小鼠,取腹腔生理盐水洗液滴于玻片,37℃温孵30min,生理盐水漂洗,干后1:1丙酮-甲醇液固定5 min,4% Giemsa染色5 min,镜下观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数。结果表12-76-6。表12-76-6 龟鳖养生丸对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(±s)组别动物(只)剂量(g/kg)吞噬百率(%)吞噬指数对照组10♂—13。71±3。810。21±0。07左旋咪唑组龟鳖养生丸组龟鳖养生丸组10 ♂10 ♂10 ♂0。056386。75±9。85***48。54±8。97***32。69±7。17***1。76±0。22***0。74±0。11***0。49±0。12***与对照组相比:* * P<0。011。2。2 对地塞米松造型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响[2]小鼠体重18～22 g,雄性,随机分组,分别按0。6 mg/20 g灌胃。对照组和模型组给以等体积水,连续10 d,自第7 d开始除对照组外每鼠灌胃给以地塞米松混悬液15 mg/kg,连续3 d,以后操作同上。结果见表12-76-7。表 12-76-7 龟鳖养生丸对地塞米松造型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(±s)组别动物(只)剂量(g/kg)吞噬百率(%)吞噬指数对照组模型组1212——54。82±4。6237。27±5。84△△1。19±0。170。66±0。11△△左旋咪唑组龟鳖养生丸组龟鳖养生丸组1212120。056373。91±6。47**67。40±12。50**57。80±5。80**1。40±0。15**1。46±0。25**1。20±0。14**与对照组相比:△△P<0。01;与模型组相比:** P<0。011。2。3 对单核细胞吞噬功能的影响[2]取小鼠40只,按性别随机分成4组。第1,2组灌服不同剂量龟鳖丸;第3组灌服双宝素;第4组灌服水;每日一次,连续7d;末次给药后1h静脉注射中华墨汁0。05ml/10g。注射后1min,5min后眼眶取血各20μl,分别放入20ml 0。1%碳酸溶液中摇匀;于680nm处测OD值,计算吞噬指数K=(logOD1-logOD2)/(t1-t2)和吞噬活性α=×体重/(肝重+脾重)。结果见表12-76-8。表12-76-8 龟鳖丸对小鼠单核细胞吞噬功能的影响n=10组别剂量(g/kg)吞噬指数(K)吞噬活性(α)龟鳖丸组龟鳖丸组双宝素组对照组60。61。60。1155±0。0207**0。1028±0。0083**0。1181±0。0243**0。0854±0。00848。024±0。629**8。042±0。736**8。230±0。783**7。221±0。514与对照组比较:* * P<0。011。3 对体液免疫功能的影响[2]取小鼠50只,按性别随机分成5组。第1,2组灌服不同剂量龟鳖丸;第3组灌服双宝素;第4组灌服环磷酰胺,第5组灌服水,每日1次,连续10d;第1次给药后第3d每鼠腹腔注射5%生理盐水CRBC混悬液0。2ml进行免疫。免疫后第7d眼眶取血,离心,取血清用生理盐水稀释100倍。取稀释后血清1ml,5%鸡红细胞悬液0。5ml,10%补体0。5ml混合;在37℃恒温30min,0℃冰箱中中止反应,离心,取上清液于540nm处比色,测定光密度(OD),结果见表12-76-9。表12-76-9 龟鳖丸对小鼠体液免疫功能的影响n=10组别剂量(g/kg)溶血素含量(光密度OD)P龟鳖丸60。638。2±3。5**36。8±3。3*<0。01<0。05双宝素环磷酰胺水1。60。0637。2±3。3*6。8±3。433。6±3。4<0。05<0。001<0。051。4 对迟发型超敏反应(DTH)的影响[2]取小鼠40只,按性别随机分成4组。第1,2组灌服不同剂量龟鳖丸;第3组灌服双宝素;第4组灌服水;每日1次,连续6d;第1次给药后第2d尾静脉注射CRBC5×106个/只致敏,致敏后第5d把5×107个/ml的CRBC和生理盐水各0。02ml分别注入小鼠后肢左右掌皮下,24h后用容积法测定足跖肿胀度,以两足肿胀度的差值作为DTH的指标,结果见表12-76-10。1。5 对淋巴细胞转化的影响1。5。1 对正常大鼠淋巴细胞转化的影响[2]大鼠体重150～253g,随机分组,分别按1mg/100g灌胃给药。对照组给以等体积水,每天1次,连续10d,末次给药后30min,无菌条件下每鼠尾静脉取血0。5ml,以肝素抗凝,3H-TdR掺入法测淋巴细胞转化能力,结果见表12-76-11。表12-76-10 龟鳖丸对小鼠迟发型反应(DTH)的影响n=10组别剂量(g/kg)足跖肿胀度差值(μl)P值龟鳖丸组龟鳖丸组双宝素组对照组60。61。637。21±12。43**26。10±5。12*40。32±15。71**17。73±10。57<0。01<0。05<0。01表12-76-11 对正常大鼠淋巴细胞转化的影响(±s)组别动物(只)剂量(g/kg)3H-TdR掺入值(cpm)P值对照组10♂—62219±17706—黄芪组龟鳖养生丸组龟鳖养生丸组10♂10♂10♂206399054±2087382312±1966286705±16729<0。001<0。05<0。011。5。2 对环磷酰胺(Cy)造型大鼠淋巴细胞转化的影响[2]大鼠体重180～230 g,雄性,随机分组,分别按1 mg/100 g灌胃给药。对照组和模型组给以等体积水,每天1次,连续10 d,于第7 d除对照组外,每鼠腹腔注射CY 75 mg/kg,末次给药后30 min,无菌条件下每鼠尾静脉取血0。5 ml,同上法测定淋巴细胞转化能力。结果见表12-76-12。表12-76-12 对CY造型大鼠淋巴细胞转化的影响(±s)组别动物(只)剂量(g/kg)3H-TdR掺入值(cpm)对照组模型组1010 86480±291344866±1821△△黄芪组龟鳖养生丸组龟鳖养生丸组101010206311816±4006**7586±1819**5470±1586与对照组相比:△△P<0。01;与模型组相比:* * P<0。01结果表明:龟鳖丸和龟鳖养生丸可增加未成年小鼠免疫器官重量,促进PHA诱导的大鼠淋巴细胞的转化增殖,增加小鼠单核细胞吞噬功能及巨噬细胞的吞噬功能,并对环磷酰胺引起的T淋巴细胞转化增殖的抑制和地塞米松引起的巨噬细胞功能的降低具有明显的保护作用,提示龟鳖丸和龟鳖养生丸具有提高免疫功能的作用。2。对阴虚、阳虚模型动物的影响2。1 对甲亢型阴虚模型小鼠的疗效[2]取小鼠50只,体重22±2g,雄性,随机分成5组。第1,2组灌服不同剂量龟鳖丸;第3组灌服杞菊地黄口服液;第4组灌服生理盐水;每日1次,连续6 d;第1,2,3,4组每天灌服甲状腺素3 mg及利血平0。02mg/只,连续6 d;第5组为正常组。记录并比较各组小鼠的体重、进食量、进水量及8 d的死亡率,结果见表12-76-13。表12-76-13 龟鳖丸对甲亢型阴虚小鼠的影响n=10组别剂量(g/kg)体重进食减少率(%)进水减少率(%)死亡率(%)给药前给药后第6d龟鳖丸组龟鳖丸组杞菊地黄组模型组空白对照组60。61。618。58±1。4319。73±1。4319。45±0。9319。30±1。8019。38±1。7617。61±3。1518。19±1。70*18。35±3。9115。51±1。11***24。12±2。18△△△32433380+3230472882+28303030900注:①进食(水)减少率=给药后第6d平均进食(水)量/给药前平均进食(水)量×100%;②“+32,+28”为正常组的进食(水)增加率2。2 对肾阳虚模型小鼠的疗效[2]取小鼠50只,雄性,随机分成5组。第1,2组灌服不同剂量龟鳖丸;第3组灌服三鞭丸;第4组灌服水;每日1次,连续15d;第1,2,3,4组于第5d肌肉注射氢化考的松25mg/ml,每日1次,连续10d;第5组为正常组。末次给药后24h,眼眶取血,处死动物,取肾上腺及睾丸称重,计算腺体指数[腺体指数=腺体重(mg)/体重(g)×10];放免法测血睾酮的含量,结果见表12-76-14。表12-76-14 龟鳖丸对肾阳虚小鼠的影响n=10组别剂量(g/kg)腺体指数(mg/10g体重)血睾酮(μg/ml)肾上腺睾丸龟鳖丸组龟鳖丸组三鞭丸组模型组空白对照组60。61。63。928±1。029**3。446±0。7002*4。215±1。382**2。653±0。76125。482±0。9866△△104。62±12。84**97。43±10。11*102。23±11。33**85。92±10。57112。36±10。76△△5。487±2。268**3。982±1。292*5。689±2。354**2。772±1。0877。035±1。976△△正常组与对照造模组比较:△△P<0。01;治疗组与对照组比较:* P<0。05,* * P<0。01结果表明:龟鳖丸对甲亢型阳虚小鼠及肾阳虚模型小鼠疗效极显著。【临床应用】治疗高血压运用龟甲养阴片治疗44例眩晕病(高血压病),男28例,女16例,40～50岁14例,51～60岁者21例,60岁以上者4例。干部38例,工人6例。中医辨证均属眩晕证肝肾阴虚型。用药后1～2个月,舒张压下降3。3kPa者为痊愈。较用药前舒张压下降2。0kPa者为好转。用药后舒张压始终未有变化为无效。结果:44例中经用药1～2个月后痊愈24例,好转18例,无效2例。龟甲养阴片有壮水制火之效,治疗此病具有标本兼顾的作用,对于肝肾阴虚型眩晕证确有满意疗效[4]。
